蛋白質定量(i-TRAQ)

蛋白質定量(i-TRAQ)

i-TRAQ的全名為Isobaric tags for relative and absolute quantitation ,亦即利用同位素”標籤”將來自不同樣本的蛋白用不同的同位素標記,造成在二級質譜圖分析時不同樣本來源的蛋白會有不同的分子量,因此可以區分出不同樣本來源的蛋白,達到同時對”多個樣本”進行大規模的蛋白定量。

服務內容

樣本經過trypsin處理後,透過化學反應將iTRAQ試劑的反應基團(amine specific peptide reactive group)與胜肽段的氨基末端共價連接在一起(右圖)。不同樣本的胜肽段分別被iTRAQ114-117(以四個樣本為例,下圖”1”)的標籤標記。

 將標記好的4組胜肽段混合後,進行LC-MS/MS分析。由於4組樣品中相同蛋白質的同一條胜肽段被4iTRAQ試劑分別標記後,其質量(M)仍然是一樣的(4種同位素標籤搭配不同平衡團後其總質量為相同)。所以在一級質譜上(MS1),它們的m/z (mass-to-charge ratio)值是相同的(下圖”3”)。經過碎裂反應後產生的碎片離子(fragment ions),可透過資料庫的搜尋推出該胜肽段為哪個蛋白質。而胜肽段上釋放出來的4個報告基團標籤—114115116117的強度即代表了4組樣品同一胜肽段的豐度(abundance)(下圖”4”)。

 

 

 

服務流程

 

 

實驗交期:約2-5周,不同規格不同交期

樣本需求

(a)樣品類型:細胞或組織萃取蛋白溶液 
(b)樣品總量: >30 ug 
(c)樣品濃度: >2.5 ug/uL
(d)分析平台: online-2DLC Orbitrap Elite

(e) 樣品溶液中不得含有 primary amine 之化合物(如 Tris-base, Ammonium Bicarobonate 等)

出貨規格

1. 結案報告一份

2. Raw data 一份

常見問題

1.Q:i-TRAQ服務能同時鑑定的樣本數為何?

A:圖爾思的i-TRAQ服務能同時鑑定分析的樣本數上限為4個樣本。如果大於4個樣本,另有TMT的同位數標記,最大極限為同時標記10個樣本。

 

2.Q:能分析比較磷酸化蛋白的蛋白變化量嗎?

A:可以,我們另有客製化的蛋白質體分析服務,一樣利用i-TRAQ標記來自不同樣本的蛋白,來達到同時定量多組樣本中的磷酸化蛋白變化。

 

3.Q:如果是血液(serum, plasma)樣本的話會有什麼樣的限制?

A:血液樣本主要會有兩大限制
(a)因為會受到albuminabundant protein影響,所以需要經過abundant protein remove 的處理,避免鑑定到大量abundant protein.

(b)血液中蛋白豐富遠遠不及其他組織,所以能鑑定到的蛋白數有限,最多約1千多蛋白

 

 

4.Q:Raw data 內的peptide confidence是?

A: 基本上跟 precursor m/z 的準確度 還有 fragment ion 跟 predicted fragment ion 的相似程度,還有false discovery rate 的計算有關 [詳細計算方式請參考mascot軟體的基本設訂]

 

5.Q: Raw data中各組有Variability (e.g 115/117 variability),此值的高低與115/117 count的關係?

A: Count 是指這個蛋白的定量值是來自於多少張 spectra,Variability 則是計算這些拿來定量的 spectra 之間的variation,越大代表定量越不準確,但若是 Count 數字很多 (>10),那 variability 就不是那麼重要,因為會取median 值來代表蛋白 ratio;若是 count 數字很小 (<5),但 variability 卻很高 (>100%),那代表算出來的 ratio 很可能是錯的。

 

6.Q:Raw data中的PEP (Posterior error probabilities of the peptide)的意思是?

A: PEP: the probability that the observed PSM is incorrect. 就是 peptide 跟 spectrum match 是錯誤的可能性。

 

7.Q: confidence (CID和HCD)代表的意思是?

A: CID 跟 HCD 都是用來撞碎 peptide 的方法,都是用來鑑定 peptide 用的 (產生圖譜), confidence是指用這兩種方法鑑別peptide的信心程度 (是依據PEP和FDR(q-value)值來判別的)