技術分享- ChIP高端實驗操作大解析

發佈日期:2018-09-20

高端實驗操作大解析

 

【什麼是ChIP】

染色體免疫沉澱技術 ——染色體,這項技術是在染色體水平上,以染色體為目標;免疫,代表利用抗體和抗原的相互作用;沉澱,代表富集純化。連起來就是利用抗體對已知抗原(組蛋白、轉錄因子等)進行免疫作用並富集目的染色體成分;而染色體由組蛋白和DNA組成,組蛋白成分已知,DNA信息多變,通過蛋白酶去除蛋白,即可獲得富集的DNA片段,再通過PCR等手段分析DNA信息,進而獲得蛋白質和DNA的互作信息。因此ChIP是一項在染色體水平上分析蛋白質和DNA相互作用的技術。
 

【ChIP用途】

通過直接對活細胞進行處理,ChIP可以真實地反應體內DNA與蛋白質的相互作用,可以檢測到細胞某一時刻的DNA與蛋白質的相互作用,可以在染色體水平上分析DNA與蛋白質的相互作用,並在基因組水平上分析整體的基因表達調控事件。
 

【ChIP實驗流程】

STEP1:
細胞固定,類似IHC實驗,直接加入濃度1%的甲醛,使細胞內狀態維持當時狀況,維持細胞內蛋白質-蛋白質、蛋白質- DNA以及蛋白質-RNA之間的連接。
 
STEP2:
斷裂染色體,通過超聲波或者核酸酶,打斷核酸鏈,將染色體片段化,使之與抗體充分接觸。
 
STEP3:
免疫沉澱,免疫沉澱步驟即是給抗體和抗原足夠時間反應。然後通過連接抗體的beads或Argarose將它們一網打盡,共同沉澱下來。
 
STEP4:
破壞鍵結與核酸純化,富集目的染色體(包含目的DNA片段)。65℃過夜解除甲醛的交聯,再用RNA酶除去RNA、蛋白酶K去除部分蛋白,最後用苯酚氯仿或者直接通過DNA純化試劑盒去除蛋白質,回收目的DNA片段。
 
STEP5:
核酸檢測,拿到DNA,接下來就是PCR檢測了,普通PCR、Q-PCR或者基因晶片等,通過陰性對照、陽性對照以及Input對照分析目的DNA富集程度,獲得實驗結果。
 
 

【ChIP實驗關鍵】

細胞固定:
進行一次 ChIP 實驗所需的最低細胞數為2 ×106 左右,建議準備過量細胞,以備不時之需。 1%甲醛固定反應可逆,便於後續操作,是較好的固定劑,37℃固定10-15 min可以滿足大部分實驗需要,但根據不同實驗項目,最佳時間也可另外摸索(時間太長可能使蛋白表位被過度修飾遮蔽,時間太短固定不足、蛋白質與DNA結合不牢固)。甲醛的固定反應可被加入的甘氨酸終止(與氨基反應),室溫5 min 即可。

斷裂染色體:
常用超聲法與酶消化法,二者都需要摸索最佳條件(最佳條件因細胞類/數量等因素而不同)。
 
a. 酶消化法:需要進行核質分離,使酶解能充分進行,細胞核提取緩衝液中需加DTT,保證酶切效率;斷裂後染色體片段控制在200-1000 bp。
b. 超聲法:超聲法不需要提取細胞核,直接加RIPA到固定好的細胞中 , 
  • 以上兩種方法,最後都需跑膠檢測一下消化結果,再進行下一步試驗。
(下圖為酶消化結果,2uL酶消耗呈現出消化過度,0.2uL消化不足,0.5uL較好,片段基本分佈在200-1000 bp。)
 
免疫沉澱:
①    抗體的特異性對於ChIP 結果至關重要,決定了ChIP 數據的質量和可信度,抗體須至少已通過IP驗證,優先考慮多抗,因為ChIP實驗中抗原表位容易被DNA包裹,從而使抗體無法結合,多抗識別多個位點,成功率更高。
②    陽性抗體對照:使用等量組蛋白H3/H4抗體或RNA聚合酶II抗體,確保實驗操作無誤;陰性抗體對照:等量normal IgG抗體(非特異性抗體),防止非特異結合,避免實驗組偽陽性
③    Input對照:取少量已斷裂稀釋好的染色體裂解液,不參與免疫沉澱,直接解交聯與核酸純化,作為基數,用於判斷實驗組的ChIP效率。
④    所有染色體免疫沉澱步驟都必須低溫(冰上或 4°C)操作。
 
解交聯及DNA純化:
解交聯時間至少4 h以上,可以過夜(貼封口膜以防蒸乾);純化DNA可以用氯仿苯酚法,但建議使用DNA純化試劑盒,可以更有效的去除雜質,收集濃度更高的DNA。
 
核酸檢測:
以Q-PCR為例,先設計引物:選擇啟動子區域(一般轉錄起始位點上游2000 bp),設計2~3對引物備用(通過NCBI數據庫查詢啟動子區域,Primer 軟件設計對應的引物序列),擴增長度不宜過長,70-200 bp較好。再將Input對照最終純化的DNA梯度稀釋後作Q-PCR,製作標準曲線。然後根據Ct值分別計算實驗組和陰性抗體組定量值,富集倍數=實驗組/陰性對照組,一般富集倍數5倍以上,可判為陽性,即初步確定蛋白質和DNA之間的互作關係。
(下圖為Proteintech公司Histone H4 Antibody(貨號16047-1-AP)對四個不同基因的放大情況,可以看見相對於陰性對照Normal Rabbit IgG(30000-0-AP),放大倍數均在5倍以上,表明Histone H4蛋白與四個基因片段都有相互作用。)
 

 

文章出處:研發部 ProteintechGroup公眾號

 

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