技術分享-如何正確選擇ELISA技術的標準曲線

發佈日期:2019-04-19

1. 前言

     酵素連結免疫吸附分析法 (enzyme-linked immunosorbent assay;ELISA) 是一種利用96孔盤的方式,檢測生物樣本 (如 peptide、抗體、激素等) 中目標蛋白的濃度.

    在完成 ELISA實驗後,最重要的工作就是如何把OD值轉化為濃度,以達到分析數據的目的。樣本濃度的的分析是根據標準品數據所生成的標準曲線完成的。要確保樣本結果的準確性,首先就要保證標準曲線盡量能還原抗原抗體的動力學反應過程。

常用的方法是excel繪圖,或者用繪圖專用軟件curve軟體做圖。常用的函數excel都能歸納,但是excel能歸納的曲線模型比較有限,而專業的curve軟體能模擬的回歸曲線就比較多也比較全面。所以目前專業的curve軟件是目前最流行的數據處理軟件之一。

    圖爾思SuperLab強烈建議使用CurveExpert 1.4進行計算

2. 標準曲線種類

在軟體裡面,常用的曲線回歸方程主要為以下6種:

     1. 一般線性擬合回歸方程式:

線性回歸是最簡單的回歸模型,也是最基本的曲線回歸分析方法, 將所有的測試點擬合為一條直線,其擬合函數方程式為:y=a+bx

     2. 二次多項式擬合回歸方程式:

二次多項式為拋物線狀,開口向下或者向上,在很多ELISA實驗中,由於曲線的特性,同一個濃度值在曲線圖上可能表現出沒有對應的OD值、有一個OD值,或者兩個OD值,所以使用二次多項式擬合時,最好保證取值的範圍都落在曲線的升段或者降段,否則哪怕是相關係數很好也很可能與實際的值不一致。其擬合函數方程式為:y = a + bx + c x2 ,形狀如下圖:

     3. 三次多項式擬合回歸方程式:

三次多項式像倒狀的'S'形,在實驗結果剛好在曲線的升段或者降段的時候,效果還可以,但是對於區間較廣的情形, 由於其彎曲的波動,三次方程擬合模擬不一定很好.跟二次方程擬合一樣,看曲線的相關係數的同時也要看計算的點在曲線上的分佈,這樣才算出理想的結果。擬合函數方程式為:y = a + bx + c x2 + d x3 ,形狀如下圖:

     4. 對數擬合回歸方程式:

半對數擬合即將濃度值取對數值,然後再和對應的OD值進行直線回歸,理想的狀態下,在半對數坐標中是一條直線,常用於濃度隨著OD值的增加或者減低呈對數增加或者減少的情況,即濃度的變化比OD值的變化更為劇烈的時候。擬合函數方程式為:y = a lg(x) + b ,形狀如下圖(注意其X軸是對數坐標):

     5. Log-Log擬合回歸方程式:

Log-Log擬合和半對數相似,只是將OD值和對應的濃度值均取對數,然後再進行直線回歸,擬合函數方程式為:lg(y) = a lg(x) + b ,形狀如下圖:

     6. 4-PL擬合回歸方程式:

4-PL應用的公式為:

此公式於Competitive 和sandwich ELISA都可以用到。它的形狀, 根據情況, 可能是一個單調上升的類似指數, 對數, 或雙曲線的曲線, 也可能是一個單調下降的上述曲線, 還可以是一條S 形曲線。它要求X 值不能小於0 (因為指數是實數, 故有此要求)。在很多情況下它都可以擬合ELISA 的反應曲線, 所以它也成了ELISA 中應用最廣的模型之一。

3. 選擇公式上的原則

公式的選擇上,以下面兩點為原則:

  1. R2值較高的公式
  2. 曲線應平滑上升並且非常類似於直線

在一般情況下,選擇Quadratic Fit (4-parameter algorithm,4PL) 是較佳的選擇.當樣品高濃度與低濃度差異極大的時候,4PL這種曲線範圍較廣的標準曲線,未知樣品帶入計算所得到的濃度值較正確.

    但由於每次蛋白質與抗體的結合狀況以及速率皆不同,因此沒有任何一個公式是絕對的選擇,所以,在每次的實驗,選擇使用R2值較高的公式,才能夠更貼近該次實驗標準曲線與標準品的真實狀況,進而回推出一個較準確的樣本目標蛋白的濃度。下面圖爾思SuperLab為您列出幾個ELISA實驗常碰到的問題供大家參考:

  1. 同一個貨號、同一批lot的ELISA kit,可以只用一個標準曲線套入公式嗎?
  1.  由於每次實驗所可能影響的因素皆不同 (時間、溫度、細微操作上的差異等),  因此建議每一次的實驗都要重新做該次實驗的標準曲線
  1. 兩次實驗所使用的公式不同,樣本可以因此而相互比較濃度差異嗎?
  1.  R2值較高的公式才能夠真實呈現樣本內目標蛋白的真實濃度.因此即便是兩次實驗的公式不同,樣本之間的濃度差異依然能夠相互比較

 

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