技術分享-Western blotting實驗中產生非預期的蛋白質分子量全解析

發佈日期:2019-08-03

Western blotting 實驗中非預期的蛋白質分子量全解析

 

    進行Western blotting實驗到最後呈色階段總是最讓人興奮與期待,我們總期待得到一個背景清澈透明乾淨且不會一絲一絲、單一蛋白質條帶以及出現在 ”預期分子量大小”的條帶位置。得到背景乾淨的呈色結果只能算是最基本的預期,這個環節只要製膠的溶液品質好、製膠混合液均勻、抗體稀釋倍數適當、作用時間恰當、清洗時間及呈色劑作用條件抓到完美比例,達到這結果並不難。但往往在得到單一染色條帶而正感到興奮不已時,卻發現條帶的分子量大小位置與預期不同,天啊!這真是晴天霹靂且一陣寒意從腳底往頭上衝。其實,別擔心,因為這有可能是正常的結果,因為蛋白質的世界有如海底針很多和蛋白質本身特性的因素都會造成這樣的結果。圖爾思SuperLab在這篇文章會告訴大家有哪些原因會讓您的蛋白質分子量大小造成變異:

 

  1. 蛋白質N端上的signal peptide在細胞中運送時被切除:有些蛋白質在細胞合成後其N端會帶有signal peptide,而在蛋白質運送到特定胞器的過程中signal peptide會被切除,此時的蛋白質才會發揮其生物活性。通常signal peptide的長度大約為 15~35 各氨基酸,也就是大約 1.6~4.0kDa,因此若您的目標蛋白質帶有signal peptide,則進行Western Blot後結果就非常有可能出現分子量小於預期的條帶。
  2. 蛋白質的後修飾作用(PTMs):幾乎所有的蛋白質大小預測軟體都是依照蛋白質的序列將氨基酸的分子量大小加總給出分子量大小預測值。但在真核細胞中,幾乎大部分的蛋白質都會進行後修飾作用(PTMs),例如:醣基化(Glycosylation)、磷酸化(phosphorylation)、泛素化(ubiquitnation)...,因為這些蛋白質必須經過後修飾作用才能發揮其生物功能或是讓結構更加穩定。因此經過後修飾作用的蛋白質其分子量通常會變大且有些後修飾作用增加的基團數量也不一定,所以得特別留意。
  3. 蛋白質複合物(protein complex): 蛋白質於細胞中常常會自己和自己結合或是和其他蛋白質以非共價鍵的方式相互結合形成蛋白質複合物(protein complex)而發揮生物功能,例如:homodimer 和 hetrodimer。因此,我們通常會在進行樣品前處理時加入如 2-Mercaptoethanol 或是DTT加熱變性將非共價鍵打斷,將蛋白質恢復成單體,但雖然經過處理,但還是仍然有機會無法完全將蛋白質複合體分離,此時就會出現非預期分子量的蛋白質條帶出現。
  4. 具有 isoform 的蛋白質:真核細胞在 mRNA 轉譯成蛋白質的過程當中,因為 exon-protein-coding 序列長度的不同,即便同一個基因產生的蛋白質的大小也會不同,所以這類型的蛋白質在不同的組織分子量大小也是不相同的。所以當萃取組織總蛋白質進行Western blotting實驗時就會出現不同分子量的條帶。
  5. 實驗操作層面的問題:這部分就牽涉到抗體專一性的問題,當抗體專一性不足而辨認到非目標蛋白質時,操作者會馬上發現分子量不對,若剛好目標蛋白質帶有Flag-tag或是Myc-tag等可以換anti-Flag或Myc-tag的抗體做一次測試。因為並非每個想研究的蛋白質都剛好有可使用的抗體,所以會將目標蛋白質的N端或是C端融合tag蛋白質序列,這樣就可以用辨認tag的抗體進行偵測,當出現分子量不同的狀況時就可以考慮前述的4種狀況,而不考慮抗體專一性的問題。另一個操作層面的問題來自於蛋白質純化過程不當使得蛋白質降解,依照降解程度,所偵測的目標蛋白質也會出現大小不一的片段被偵測到,故在萃取蛋白質操作過程中應盡量保持低溫甚至在冷房操作,選擇適合的蛋白酶抑制劑添加降低降解的風險。切記,使用新鮮萃取的蛋白質進行實驗時,若多次的低溫反覆回溶也會造成蛋白質的降解。最後,進行蛋白質電泳所使用的protein marker有其適合的膠體泳動緩衝液條件,在不同的緩衝液系統,其所代表的分子量會有所差異,如同一管marker在Tris-Glycine、MOPS及MES緩衝液系統中跑出來的條帶所代表的分子量就不一樣,所以必須確認所使用的緩衝液系統然後查詢原廠所提供的資料表標示分子量的大小。且每次實驗記錄若不記錄所使用廠牌及條件,必須在數據上標示正確分子量,否則每家廠牌的條帶也代表不同的分子量,雖然跑起來一樣,但卻代表不同的分子量,這會造成數據判讀的錯誤。

 

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