COVID-19新型冠狀病毒檢測方式與危機

發佈日期:2020-02-10

COVID-19新型冠狀病毒檢測方式與危機

近日全球因為中國武漢地區爆發了肺炎疫情而整個緊張起來,除了防範疫情的擴散及研發最佳治療方法外,由於初期發病症狀與一般感冒症狀相似,最重要的是如何在一開始確認疑似感染者是否被新型冠狀病毒(COVID-19)所感染而進行後續的隔離及治療,所幸目前的核酸定序及分子偵測技術的進步,當科學家第一時間分離及純化病毒顆粒後,純化病毒RNA後以NGS技術得到完整的核酸序列(COVID-19單條RNA長約30 Kbps)後,就可以根據序列資料比對出其基因ORF,有了這些資料後最快速的方法就是利用即時定量聚合酶連鎖反應(Quantitative real-time PCR , qPCR)偵測病毒核酸的存在,這也是為何當爆發出疫情後檢測試劑快速被開發出來的原因。

  

  首先,根據病毒的核酸序列與宿主基因體序列差異最大及COVID-19與其他冠狀病毒序列不同的區域設計出專一性的引子對(primer set),為了增加其專一性可使用TaqMan系統多設計一條專一的螢光引子探針,利用這三條引子進行qPCR就可以專一偵測COVID-19是否存在於檢體中;若是搭配氯化銫梯度離心所純化且定量過的病毒核酸,更可以推算出檢體中所含病毒顆粒的多寡。

 

實務上的操作流程——

  1. 取得檢體:新型冠狀病毒侵襲呼吸道系統後病毒顆粒以飛沫傳染,故以採樣棒於咽喉或鼻腔處擦拭即可採取代測樣本,由於具感染性的樣本需要P2等級以上實驗室才能操作。為了保護操作人員,在樣本送到操作人員前必須將病毒外鞘蛋白變性降低或消滅其感染性,最快及簡易的方法就是以65度加熱檢體,由於RNA被外鞘蛋白所保護並不會因這溫度降解。
  2. 萃取樣品RNA:將失活的病毒檢體以Trizol或是RNA萃取試劑組進行萃取及總RNA定量。
  3. 樣品cDNA的合成:由於新型冠狀病毒為RNA病毒,所以要進行qPCR之前必須將RNA反轉錄成cDNA,可採用反轉錄試劑組依照其標準流程進行即可,唯一一個要注意的地方是,RNA病毒上並不會有poly-A tail,在反轉錄時需要注意使用random hexamer、病毒序列上專一引子或是兩者混合的引子。切記不可使用Oligo-dT引子,這樣只會反轉錄宿主的mRNA。
  4. 即時定量聚合酶連鎖反應:將檢體cDNA與病毒專一引子對與SYBR Green master mix混合後,即可進行反應;若是使用專一螢光探針的TaqMan系統,除了病毒專一引子對外需加入專一螢光探針引子及適合的Hot-start Taq master mix。
  5. 數據判讀:判讀檢體的Cq值是否存在病毒核酸,Cq值在38之內為陽性,Cq值大於40為陰性,介於38-40間需要再一次檢測,但確診的Cq值範圍必須先做測試才能決定。若是後期已有純化且定量過的病毒核酸可以最低copy數所得Cq值作為一個判斷標準,也就是偵測極限的Cq值判定。

 

 

偵測病毒所遇到的困難——

  由於本次爆發疫情的敏感度,檢測的速度將決定於檢測試劑組是否精良、足夠的P2實驗室設備及技術熟練的生技人員。首先檢測試劑其關鍵引子對的合成在台灣並不會短缺且合成快速,關鍵是能越早拿到病毒核酸序列還有引子對的專一性要夠,若是嚴謹的判斷,必須設定三個偵測區域進行檢測,若兩個以上的區域被偵測到,才會被判定確診,這確診的嚴謹度決定於防疫單位的設定,若是越嚴謹的判定就會增加上機的數目,這樣一次可檢測的樣本數目減少。由於這是感染性的樣本,雖然很多實驗室都有qPCR上機的設備,但操作感染品必須要有P2等級以上的特定實驗室才能操作,這些實驗室有嚴格的氣流設定、安全標準操作流程等,所以可進行檢疫測試的實驗室數量就被限制了。

  最後是操作人員的技術及樣品的數量,優良的技術人員可以減少重複檢測的次數,但一次操作的樣品數量無法太多,這關係到樣品間交叉汙染的問題,若是謹慎操作是無法一次同時由同一個人操作太多樣品的。最後一個原因,為何最近會看到國際新聞上有人需要做多次檢測後才能確診是否感染新型冠狀病毒,其原因可能是採樣時沒有採到足夠的病毒顆粒,這是由於每個人體內病毒潛伏時間不同若是病毒數量不足,或是檢體中所含病毒經過RNA萃取損失、cDNA反轉錄效率影響後最終可以真正進入qPCR中的病毒核酸copy數已經低於偵測極限,除了檢體中發病初期病毒數量低,操作人員的技術及試劑套組的穩定及效率也會影響確診的真偽。

 

以上的實驗設計流程也適用於任何病毒或是病原體的偵測,病毒必須注意為DNA或是RNA病毒即可。

 

 

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