| 蛋白質表達 | 重組蛋白內涵體的復性策略

發佈日期:2021-08-24

| 蛋白質表達 | 重組蛋白內涵體的復性策略

大腸桿菌表達系統是目前最常見用來表達重組蛋白的宿主,具有基因完全解序、不同表現株系統可供選擇、繁殖速度快、培養容易、可大量生產目標蛋白與生產成本低等優點,深受科研與工業用戶喜愛。

但大腸桿菌表達系統卻也因為高度表達的特性,可能會在培養過程中以較高的溫度培養、較高濃度的誘導劑或使用強力的啟動子系統(Strong Promoter),加快蛋白質轉譯生產速度,造成錯誤摺疊或折疊不完整,容易產生不溶的蛋白聚合體,內涵體(inclusion bodies)。內涵體的產生與原核表現系統的蛋白生成機制有關,不像真核表達系統具有轉譯後修飾(post translational modification,PTM)、伴護蛋白(chaperone proteins)等幫助蛋白正確摺疊。目前形成內涵體機制還不清楚,但是可以利用內涵體不容易被蛋白酶降解與易沉澱、可以簡單利用離心蒐集的方式,我們可以容易蒐集到大量且高純度的重組蛋白,然後再利用體外溶解(solubilization)成變性狀態(denature)及再摺疊(refolding)的方式使蛋白質恢復活性。

包涵體要回復成有活性的天然蛋白(native proteins),主要有4個步驟,分別是洗滌(washing)、溶解(Solubilization)、復性(refolding)與純化(purification)等,其中溶解與復性是最關鍵的步驟,分別說明如下:

1. 洗滌(washing),包涵體在溶解之前通常會先洗滌,主要去除大腸桿菌內的雜質,如DNA、RNA、膜蛋白等。通常利用低濃度的變性劑,如1-2M尿素(Urea)、1% Triton X-100。

 

2. 溶解(Solubilization),在包涵體中,重組蛋白都處於錯誤摺疊的狀態,要讓蛋白變性,就是要破壞非共價鍵的鍵結,像是離子間的相互作用力,如氫鍵(hydrogen bond)、凡得瓦力(van der Waals' Forces)、疏水力(hydrophobic bond)等並用還原劑(β-ME)打開雙硫鍵,使內涵體完全伸展為無摺疊的多肽鏈。常用的變性劑有6M 鹽酸胍(GuHCl)、8M尿素(Urea)、0.3% Sarkosyl(月桂醯肌氨酸鈉) or SDS(十二烷基硫酸鈉)

 

3. 復性(refolding),是指藉由去除變性劑,使目標蛋白從完全伸展的變性狀態恢復到正常具有摺疊結構,同時去除還原劑讓雙硫鍵再形成,讓蛋白質恢復二、三級結構。目前常見的蛋白質復性方法有下列幾項:

A. 透析法(Dialysis) : 通過逐步降低外部透析液中變性劑的濃度,使透析袋內部變性劑的濃度也逐漸降低。需要耗時長,容易形成沒有活性的蛋白質聚合物,一般多為實驗室使用,不適合大規模工業應用。

B. 稀釋法(Dilution) : 將變性蛋白直接加入水或者緩衝溶液,降低變性劑濃度,使蛋白再重新摺疊,需要放置過夜,缺點是會增加體積,但方法最簡單有效、易操作。稀釋的蛋白終濃度一般控制0.01mg/ml以下,防止大量的蛋白沉澱的形成並提高回收率。

 

C. 分子篩過濾法(Size exclusion chromatography) : 利用管柱層析技術,膠體分子篩可將蛋白質和小分子變性劑分離,完成溶液交換和蛋白質的折疊復性。分子篩過濾能在高濃度得蛋白下進行復性,且回收的活性蛋白量也多,同時也有一定程度的純化效果。

 

4. 純化(purification),重組蛋白的純化過程,一般常用的的分子篩(Size exclusion)、離子交換樹脂( Anion exchange)與親和性樹脂(Affinity)等層析方法,根據不同重組蛋白的特性,可分別選擇與其相對應的層析管柱來進行蛋白純化的工作。

 

內涵體的溶解與復性,是每一個利用大腸桿菌表達系統生產重組蛋白的研究者都會遇到的難題,圖爾思生物科技所代理的 CROYEZ 品牌,是台灣研發團隊,專精於免疫研究與重組蛋白開發技術,能夠提供您任何相關的重組蛋白生產服務,不管是基因選殖與構築、蛋白表達服務,內涵體的再復性,都有專業的研發團隊,協助您解決問題,推展您的科研項目。

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