【RNAseq小學堂】基因表現量方法比拼 RNAseq vs. Microarray

發佈日期:2021-08-27

【RNAseq小學堂】基因表現量方法比拼

RNA-seq vs. Microarray

不知道你有沒有做過北方墨點法 (Northern blot) 的實驗呢?在將電泳結果轉移到尼龍膜上時,堆疊濾紙片是否小心翼翼排除氣泡?或是擔心擦手紙堆被撞倒?在使用X光底片偵測序號時,是否反覆測試曝光時間?漫長的實驗卻只能分析單一基因的表現量。又或著,你是否進行過 real-time qRT-PCR 實驗?96 孔盤一次可進行數十個基因表現量分析,若一次想看更多的基因表現該如何進行?是設計更多的引子進行 real-time qRT-PCR 實驗嗎?

 

隨著基因表現微陣列 (Gene expression microarray, microarray) 與 RNA 定序 (RNA sequencing, RNA-seq) 技術的問世,幫助科學家單次實驗可分析數萬個基因表現量,究竟這兩項高通量技術有什麼差異呢?

 

Gene expression microarray 是在晶片上,密集排列經過設計的核酸探針,藉由核酸間的雜合作用偵測基因表現。實驗過程先將 mRNA 反轉錄成 cDNA,再進行胞外轉錄反應 (in vitro transcription) 獲得經過標記的 cRNA,最後進行螢光染色即可偵測螢光訊號判斷基因表現量。該技術有訊號背景值高較窄的可偵測範圍 (dynamic range) 等特性,在低表現基因的偵測靈敏度較差。若個體間同基因存在序列變異時,雜合效率也會受到影響,因此只能進行相對定量的分析。此外,探針必須根據參考序列設計,使得 microarray 只能偵測 ”已知” 序列。由於探針可以客製化設計,該技術經常發展出特定研究領域的專用晶片,用於大量樣品的快速檢測。

 

RNA-seq 是在次世代定序儀上,高通量進行 cDNA 文庫定序。實驗流程先將 RNA 反轉錄成 1st strand cDNA,再進一步合成雙股 cDNA,最後於兩端接上轉接子 (adapter) 完成建庫。Adapter 序列讓文庫能在定序晶片上擴增成叢集 (cluster),並逐一合成帶有螢光標定的鹼基進行偵測,藉由紀錄每個 cluster 連續合成的螢光訊號,再轉換成鹼基序列完成定序,該技術的背景值較低,且可偵測範圍較廣,還有準確度高達 99.9% 的優點。後續將數據比對參考基因體序列,計算每個基因覆蓋的序列數,藉此分析基因表現量。數據也可用於組裝分析,研究選擇性剪切 (alternative splicing) 和融合基因 (fusion gene) 等序列結構,以及新物種的轉錄體研究。

 

隨著定序成本逐年降低,RNA-seq 已經擺脫昂貴技術的刻板印象,如今轉錄體研究蓬勃發展,科學家需要的不僅僅是基因表現量資訊,序列變異序列結構也是研究多年的熱點。當分析工具或是註釋資料庫更新時,RNA-seq 數據很容易進行重新分析,而 microarray 必須重新設計探針和重新實驗,才能獲得最新的註釋資訊。看完了以上介紹,如果還是不清楚 microarray 和 RNA-seq 的差異,請看以下表格:

 

 

Microarray

RNA-seq

Principle

Hybridization

Next-Generation Sequencing

Resolution

100-200 bp

1 bp

Throughput

High

Very High

Reference genome

required

optional / De novo

Background /noise

High

Low

Detect Novel Gene

No

Yes

Full gene sequence

No

Yes

Function

Specific

SNP/INDEL/isoform

Re-analysis

No

Flexible

 

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