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2016．06
癌症檢測新靶標 - exosome circRNA
與傳統的線性RNA相比， circRNA是封閉環形結構，表達更加穩定，不易降解。外泌體(exosome)攜帶有蛋白、mRNA和microRNA等，可以作為疾病診斷的生物標記(Biomarker)。但是目前關於外泌體中circRNA研究較少，它是否可以作為疾病診斷的標誌物呢？ 小編利用一篇2015年發表於Cell Research的文章，來介紹研究人員首次在人血清中發現大量外泌體circRNA，並發現這些circRNA有可能作為癌症診斷新的生物標記。
方法與結果
實驗選取細胞、細胞分泌的外泌體、正常血清外泌體和CRC血清外泌體，採用鏈特異性建庫，利用illumina HiSeq 2500，資料量為30-46M，利用TopHat v2.0.8b 對定序資料與人類的參考基因組比對，另外通過SRPBM對細胞內的circRNA和外泌體攜帶的circRNA進行定性和定量，並用Circos plots展示結果。
1. 外泌體中存在大量circRNA
研究人員採用 RNA-seq 從 MHCC-LM3 肝癌細胞及其外泌體中分別鑑定出 5,484 和 6,751 個 circRNAs，且發現外泌體 circRNA 的表達量是細胞中表達量的2倍以上。對細胞中poly(A) RNA純化並進行RNA-seq分析發現polyA(+) RNA-seq文庫中幾乎不存在circRNA。
圖1. (a) 細胞與其外泌體中circRNAs的Circos圖 (b) 不同RNA-seq文庫中circRNA的數目
2. 外泌體中circRNA功能與miRNA相關
之前的研究表明，CDR1as circRNA對miR-7起"海綿作用"。本研究將miR-7類似物加入細胞中，發現CDR1as circRNA在外泌體中表現量明顯下降，而在細胞中輕微上升。進一步研究發現，CDR1as 外泌體可解除miR-7的生長抑制。
圖2. (左) miR-7類似物對細胞及外泌體中CDR1as circular RNA表現量影響 (右) CDR1as外泌體降低miR-7 的生長抑制作用
3. 人血清中circRNA的結構特點與特性
研究人員對人血清中的外泌體RNA進行RNA-seq分析，共鑑定出1,215個circRNA，發現其中90%都有外顯子結構，平均長度為350 nt，且具有不易被RNase R降解、穩定性高的特點。
圖3. (左) qRT-PCR分析RNase R處理對外泌體circRNA影響 (右) 室溫24h內外泌體circRNA的變化
4. 構建出小鼠肝癌模型
研究人員構建了人肝癌細胞異種移植小鼠模型，發現在異種移植小鼠血清中CDYLcircRNA高表現，並且CDYL circRNA水平與腫瘤體積正相關。
圖4. (左) 正常小鼠和異種移植小鼠血清中CDYLcircRNA表現水平 (右) 異種移植小鼠腫瘤重量與CDYLcircRNA水平相關性
5. 直腸癌患者血清中外泌體circRNA表現量高於正常人
與正常人血清中外泌體circRNA相比，直腸癌患者缺少了67個原有circRNAs，增加了257個新的circRNAs。qRT-PCR進一步分析驗證在直腸癌患者血清中circ-KLDHC10表現量明顯高於正常人。
圖5. (左) 正常人與直腸癌患者血清中外泌體circRNA比較 (右) qRT-PCR對正常人與直腸癌患者血清中circKLDHC10檢測
推論
外泌體circRNA將可能作為癌症檢測新的生物標記(Biomarker)，且具有潛在的生物學功能。
參考文獻: Li Y, Zheng QP, Bao CY, et al. Circular RNA is enriched and stable in exosomes: a promising biomarker for cancer diagnosis[J]. Cell Research, 2015.
