RNA Sequencing (Quantification)

RNA Sequencing (Quantification)

此項RNA定序技術是針對樣本中所有mRNA做高通量定序分析,通常定序結果的涵蓋率(coverage)和深度(depth)是研究人員最關心的兩樣條件。mRNA定序的結果可以顯示基因的轉錄表現量。

服務流程

項目週期:樣品通過檢測後,27個工作天(含分析)

分析流程

定序完的下機數據 raw reads 以Trimmomatic 進行品質過濾獲得clean reads。Clean reads 以 HISAT2 比對參考序列(如:GRCh37, hg19, mm10)並以 featureCounts 計算各個基因表現量 (raw read counts),再透過 RLE / TMM / FPKM 對表現量做歸一化處理。
篩選差異基因根據是否有生物學重複區分為:(1)具生物性重複樣本,預設以組間基因 |Fold-Change| > 2 及 p-value < 0.05 (2) 沒有生物性重複樣本,預設以預設以組間基因 |Fold-Change| > 2 及 corrected p-value < 0.005 作為篩選門檻。篩選後以火山圖、熱圖以及主成分分析呈現差異基因結果,並利用 Gene Ontology、KEGG 進行下游的系統生物學分析。除了差異表現基因分析外,流程中亦提供 GSEA 及 WGCNA 兩種高級分析分別做生物調控路徑分析與關鍵基因集探索。

樣品需求
  1. Total RNA 總量: ≧ 2 ug

  2. RNA 濃度: ≧ 50 ng/ul

  3. 樣品體積: ≧ 40 ul

  4. RIN 值 ≧ 6.3 (植物或真菌)

  5. RIN 值 ≧ 6.8 (動物)

  6. Purity: OD260/OD280= 1.8-2.2, OD260/OD230 ≧ 2.0 (RNA無降解且無汙染)

定序規格
NovaSeq 6000, paired-end 150 bp
 

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