全長16S擴增子定序 (Full-length 16S Amplicon Sequencing)

全長16S擴增子定序 (Full-length 16S Amplicon Sequencing)

16S rRNA為原核生物核糖體小次單元的重要組成,序列包含數個保守和高變區域,其中具有屬或種特異性的高變區域,被認為是最適用於細菌系統發育和分類鑑定的指標。結合三代定序平台的讀長優勢,定序全長16S序列,能取得種 (Species)甚至到菌株 (Strain)層級的物種註釋資訊,大幅提升資料分析的解析度,因此逐漸成為微生物體領域中研究環境微生物多樣性及群落組成差異的重要策略之一。

分析流程

定序下機的原始數據會搭配 PacBio 標準軟體校正 Circular consensus sequence (CCS) 並產生 CSS reads,並定義Q值達Q20的CCS reads為HiFi reads,為了提供更高品質的數據,圖爾思提供準確率達99.9%的高規格 Q30 HiFi reads

校正後的 CCS 序列作為分析的開端,接著去除引物(Primer)與執行 DADA2 去噪分析。去噪分析後獲得 ASVs(Amplicon Sequence Variants),再接續物種分類分析,包括物種豐度、Alpha 多樣性計算、樣本物種多樣性評估、Venn 圖等分析,以得到樣品內物種豐富度和均勻度資訊、不同樣品或分組間的共有和特有 ASVs 資訊等結果。

服務流程

 

樣品需求
  1. DNA總量:

    1. PacBio平台定序: ≧ 500 ng

    2. DNA 濃度: ≧ 30 ng/ ul (Qubit®測定)

    3. 樣品體積: ≧ 20 ul
      ※樣品濃度定量
      Qubit®測定為主

  2. 樣品純度及片段大小:
    OD260/OD280 = 1.8-2.0
    DNA 無降解且無汙染
    建議先行以電泳膠圖確認片段大小及DNA完整度,並於送件時提供膠圖結果
定序規格

三代長片段定序:PacBio Sequel IIe

PacBio Sequel IIe
Courtesy of PacBioof California, Inc.

 

 

 

常見問題

Q1.  PacBio全長16S定序跟一般使用NGS進行的16S定序有什麼不一樣?

A: 16S rRNA其序列包含9個高變異區(V1~V9)及10個保守區(Conserved Regions)。一般NGS定序由於定序長度短,只能夠選擇部分高變異區進行定序,常見的選擇為V3-V4區域,而PacBio Full-Length 16S(FL-16S)定序可同時定序長達約1,500個核苷酸的全長V1-V9的高變異區,避免細菌偏好性問題,提高菌種鑑定的解析度由屬至種甚至菌株系。

Q2.  全長16S定序能提供什麼優勢?

i.     高通量-能同時分析群落中所有的微生物。

ii.    高品質數據-PacBio的HiFi reads能對序列自我矯正,數據一致性高;準確率高。

iii.   高解析度-分析16S rRNA全長,能大幅提升分辨率精確至種甚至菌株系階層。

Q3.  PacBio全長16S定序服務會有放大造成的誤差嗎?

A: 圖爾思實驗室為降低PCR放大過程中可能產生的誤差,建庫過程中僅進行一次PCR將全長16S片段放大並加上條碼,以降低多次PCR造成的實驗誤差。

Q4.  不同單位提供的全長16S序列有什麼差異嗎?CCS、HiFi、Q30 HiFi reads三者間有何不同?

A: 定序全長16S已經是目前的趨勢,但不同單位由於機型(Sequel I, Sequel II, Sequel IIe)的差異,可能會提供不同規格的reads給使用者。一般來說可能產出三種reads: CCS、HiFi、Q30 HiFi reads,HiFi reads可由Sequel IIe直接產出,這三種reads的準確率也依上列排列提升,圖爾思提供最高規格Q30 HiFi reads,保障交付可信的全長16S數據品質。

(1)     CCS reads指的是同一條全長16S模板經過多次讀取而合併為一條reads,並沒有Q值的保證,pass數越多,Q值則越高。

(2)     HiFi reads指的是Q值達Q20之CCS reads,準確率達99%。

(3)     Q30 HiFi reads指的是Q值達Q30之CCS reads,準確率達99.9%。

Q5.  每個樣本我可以得到多少的定序數據量呢?

A: 圖爾思保證比先前文獻更多更高品質的數據量,平均每個FL-16S樣品可獲得10,000/20,000條Q30 HiFi reads。

Q6.  我想知道FL-16S分析使用的是哪個資料庫?

A: 圖爾思FL-16S比對使用NCBI資料庫,因其具有較完整的全長16S序列,能幫助比對更多菌種數量,提升註解到的菌種數目。

Q7.  全長16S是否能解決拷貝數差異的問題?

A: 不同物種的16S拷貝數存在差異,全長16S定序仍無法解決拷貝數不一致導致的豐度差異。

Q8.  我希望從16S V3-V4轉移到全長16S定序,有什麼需要考慮的嗎?

A: 如果您的計畫先前已使用16S V3-V4進行了部分檢體定序,為了數據的一致性,建議剩下的檢體也使用同樣的規格進行定序。若是為一個新計劃的初始,建議使用全長16S定序以獲得更多資訊、更高解析度。

Q9.  全長16S定序的分析跟16S V3-V4的分析有什麼不同嗎?

A: 基本上除了使用的資料庫(V3-V4: Silva; V1-V9: NCBI)不同,下游分析的流程以及會提供的資訊都是一樣的,只是全長16S能提供更好的解析度。所以不會需要經歷不同分析報告解讀的陣痛期喔。

Q10.  我想知道從送樣後需要多久才能拿到分析報告呢?

A: 最久40個工作天就會寄出報告囉。

 

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