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2019．05
如何把磷酸化蛋白質的Western Blot實驗做好
蛋白質磷酸化(phosphorylation)對於調控細胞功能而言是相當重要的，細胞生長、細胞增生、細胞中的訊號傳遞等現象都與蛋白質磷酸化(phosphorylation)息息相關，因此蛋白質磷酸化(phosphorylation) 也是細胞生物學領域研究非常重要的一環。Western blot(WB)則是研究中最常使用來評估蛋白質磷酸化(phosphorylation)狀態的實驗技術，但想要把蛋白質磷酸化(phosphorylation)的Western Blot實驗做好卻往往是研究人員最大的夢魘。因此，在這篇就跟大家說明在執行此類型實驗時應該要注意的幾個事項與訣竅：
- 確定樣品中是否表達目標蛋白質：這件事情聽起來似乎很瞎，但根據我們的經驗卻是很多人常常會犯的小錯誤。所以在進行實驗前必須要通過文獻來查詢您的樣品中是否含有要檢測的磷酸化蛋白質(phospho-protein)，而更好的方式建議先做一個前測試實驗來檢測樣品中磷酸化蛋白質(phospho-protein)的表達量，若表達量偏低或根本偵測不到則建議可以將樣品以蛋白質體學(Proteomics)的方式進行檢測或是於樣品中加入刺激物促進磷酸化蛋白質(phospho-protein)的表達，總之，先確定樣品中真的含有您的目的磷酸化蛋白質(phospho-protein)是非常重要的。
- 檢測總蛋白質(total protein)表達量是否發生變化：只偵測磷酸化蛋白質(phospho-protein)的表達量並無法真實的說明細胞中磷酸化狀況，只有將磷酸化蛋白質(phospho-protein)與總蛋白質(total protein)相比，比值的升高或是降低才是有意義的實驗數據。
- 抑制磷酸脢(phosphatase)的干擾：由於蛋白質磷酸化(phosphorylation)是一種可逆的反應，所以在樣品的製備過程與實驗的整個過程當中都必須要留意細胞內源性或是外源性磷酸脢(phosphatase)的干擾，因此為了避免這個干擾，我們建議在整個過程中添加足量的蛋白脢抑制劑(protease inhibitor)與磷酸脢抑制劑(phosphatase inhibitor)，而外源性的磷酸脢(phosphatase)通常是實驗過程中的污染所造成的，因此在樣品製備的過程當中請務必使用不含磷酸脢(phosphatase)的試劑，而值得特別注意的是樣品中或是實驗環境中的細菌也會分泌磷酸脢(phosphatase)，因此也要特別留意。
- 抗體的選擇：通常好的抗體可以決定 70% Western Blot的成敗，所以挑選好的磷酸化抗體絕對是一個非常重要的關鍵。
