冷凍細胞，真的需要「快速冷卻成核」嗎？

 

良好的細胞冷凍保存依賴可控的冷卻速率。冷卻過快或過慢都會導致較差的細胞存活率結果，這是因為細胞在冷凍過程中會面臨物理環境的劇變。當細胞外的液體結冰時，純水會形成冰晶，導致剩餘溶液濃度升高，造成細胞脫水。如果冷卻太慢，這種高濃度溶液會變得對細胞有毒；但如果冷卻太快，細胞來不及脫水，則會在細胞內形成冰晶，進而損傷細胞。因此，控制冷卻速率對於維持細胞存活與功能至關重要。

可控的冷凍速率，例如使用只消耗電的 VIA Freeze 系統或液態氮（LN₂）冷凍系統，通常會以線性速率降溫。一些使用 LN₂ 系統的研究人員傾向在降溫過程中插入「快速冷卻成核步驟（rapid-cooling nucleation step）」，他們認為這樣可促進冰晶成核，有助於提升解凍後的細胞表現。圖 1 顯示線性冷卻與包含快速冷卻成核步驟的冷卻曲線。


本研究探討快速冷卻成核步驟對四種細胞株之細胞存活數與活性的影響。測試的三種條件包括：使用 VIA Freeze 系統進行線性速率冷凍；使用液態氮（LN₂）冷凍系統進行線性速率冷凍；使用 LN₂ 冷凍系統，並在冷凍過程中加入快速冷卻成核步驟的線性速率冷凍方式。

 

▌實驗設計 

裝有細胞的抗凍管（1 mL）以 2°C/分鐘的速率，從 4°C 降至 -60°C，使用兩種可控速率冷凍系統進行實驗：VIA Freeze 系統（Cytiva）與傳統液態氮（LN₂）冷凍系統（Kryo 560，Planar）。第三種冷凍方式則在同一台 LN₂ 冷凍機中加入快速冷卻成核步驟，其程式設定如表 1 所示。

每種條件均使用 5 管細胞樣品，並加入 10% DMSO 作為抗凍劑。在所有實驗中，當樣品降至 -60°C 時立即投入液態氮中儲存，並在 -140°C 以下保存至少 24 小時，之後進行解凍。解凍後的細胞轉移至細胞培養基中，並在標準濕度 CO₂ 培養箱中 37°C 培養。

本研究評估了四種細胞株，包括：

1. 中國倉鼠卵巢細胞（CHO）
2. HepG2 細胞（人類肝細胞）
3. MG-63 細胞（人類骨骼細胞）
4. Jurkat 細胞（人類懸浮性免疫細胞）

細胞解凍後的細胞存活數，使用 Cytell 細胞影像分析系統（GE）進行測定；代謝功能則透過 alamarBlue™ 生物檢測法，使用 Tecan™ 微量盤讀取機在細胞培養後 3 小時進行分析。上述功能性測試皆於解凍後的第 24、48 及 72 小時進行評估。

▌不同冷凍方式的結果

圖 2 顯示，HepG2 細胞在使用液態氮（LN₂）冷凍系統冷凍時，無論是否加入快速冷卻成核步驟，其解凍後的表現皆無顯著差異。此外，無論使用哪一種冷凍設備，只要採取相同的線性冷卻速率，其結果也沒有明顯差異。

CHO 細胞（圖 3）亦呈現相同結果；Jurkat 與 MG-63 細胞的測試結果亦呈現相同趨勢，但為簡潔起見，未在本文中展示。

▌結論

圖 2 顯示，HepG2 細胞在使用液態氮（LN₂）冷凍系統冷凍時，無論是否加入快速冷卻成核步驟，其解凍後的表現皆無顯著差異。此外，無論使用哪一種冷凍設備，只要採取相同的線性冷卻速率，其結果也沒有明顯差異。
本研究結果顯示，在液態氮（LN₂）冷凍系統中加入快速冷卻成核步驟，並未改善四種細胞株的解凍後表現。此外，並無文獻證據支持「快速冷卻步驟能促進成核進而提升細胞冷凍保存效果」的假設。

▌使用 VIA Freeze 系統進行細胞冷凍

除了證實快速冷卻步驟並非必要之外，本研究亦顯示，只要設定線性冷卻速率，VIA Freeze 系統與 LN₂ 冷凍系統在細胞存活率與功能性上具有相當的表現。儘管兩者冷凍效果相近，VIA Freeze 系統相較於 LN₂ 可控速率冷凍設備具備數項優勢：其設計採隨插即用，操作簡便，不需使用液態氮冷卻，能有效降低污染風險並提升 GMP 相容性。此外，具備低功耗的表現，亦有助於降低操作成本。是高效且安全的細胞冷凍解決方案。

▌參考文獻

1. Diener B et al. A method for the cryopreservation of liver parenchymal cells for studies of xenobiotics. Cryobiology 30, 116–127 (1993).