外泌體純化怎麼做？從樣品特性選擇分離方法與品質驗證

實驗室決定進行外泌體研究時，常卡在幾個問題：細胞培養上清液、血漿或尿液該用同一套純化方法嗎？超速離心、尺寸排阻層析與沉澱試劑，各適合什麼情況？分離後測得的顆粒濃度看起來很高，卻無法僅由顆粒數判斷其中有多少屬於外泌體，或有多少來自蛋白聚集體、脂蛋白及其他非外泌體顆粒。流程沒先規劃好，後續的蛋白質體學研究、核酸定序、功能研究或製程放大都會受影響。

以下從樣品與實驗目標的定義開始，接著比較六種常見的分離方法及操作重點，再說明如何建立純化流程、做品質確認和排查不穩定的結果，最後回答選擇方法、組合流程與臨床用途的常見疑問，方便研究者、採購與技術窗口判斷自己的實驗條件適合哪條路線。

外泌體純化前先定義樣品與實驗目標

外泌體純化沒有單一最佳方法。適合的流程取決於四個條件：

1. 樣品來源
2. 樣品體積
3. 下游用途
4. 以及研究可接受的純度與回收率

例如，從 500 µL 血漿中分離 EV 並用於 miRNA 分析，和從 2 L 細胞培養上清液中製備 EV 並用於功能試驗，需要的設備、步驟數與品質評估方式都可能不同。

用詞方面，國際細胞外囊泡學會 (ISEV) 發布的 MISEV2023 指引建議，若無法證明囊泡來自內體途徑，應使用細胞外囊泡 (extracellular vesicles，EV) 這個通稱，或依粒徑稱為小型 EV。本文沿用讀者熟悉的外泌體一詞，但實務報告與論文投稿時，建議依 MISEV 的用語規範描述。

規劃之前，先分清楚三個常被混用的操作目的：

操作目的	主要目標	常見做法	結果特性
分離 (separation)	把 EV 與非 EV 成分分開	密度梯度離心、尺寸排阻層析、免疫親和	著重去除干擾物
濃縮 (concentration)	縮小體積、提高單位體積的顆粒數	超濾、切向流過濾、超速離心沉降	可能同時濃縮雜質
純化 (purification)	在分離基礎上把非目標物降到下游研究可接受的程度	多種方法串聯	純度提高，但通常會損失部分回收

以超濾 (Ultrafiltration, UF) 為例，雖然可以縮小樣品體積，但分子量大於膜孔徑的蛋白也會一起留下，所以它屬於濃縮步驟，不能直接當作純化。把三者分開定義後，才能判斷每一步要解決哪個問題。

研究用樣品也要從一開始就保留完整紀錄，至少包括：

• 樣品資訊：來源、採集管種類 (例如: EDTA 或檸檬酸抗凝管)、採集到處理的時間、是否溶血、儲存溫度與凍融次數。
• 細胞培養條件：細胞株與繼代數、培養基與血清種類 (是否使用去除 EV 的血清或無血清培養)、收集時的細胞密度與存活率。
• 操作參數：離心力 (×g)、時間、溫度、轉子型號、管柱或膜材的批號、緩衝液組成。
• 批次資訊：試劑與耗材批號、操作人員、儀器編號。

這些資訊決定結果能不能重現，也是日後排查變異的依據。ISEV 支持的 EV-TRACK 平台就是用類似的方法學資訊評估研究的透明度。
 

外泌體純化的純度與回收率如何取捨

純度與回收率通常此消彼長，不同分離方法在 EV 回收、非 EV 成分去除、處理量與操作複雜度之間通常需要取捨。例如，沉澱法常可得到較高的總顆粒回收，但也可能共同富集可溶性蛋白、脂蛋白與核酸複合物，造成讓顆粒數與蛋白濃度都偏高。密度梯度離心的純度較好，但步驟長、損失多，小體積樣品可能收不到足夠的量做下游分析。

非目標物對下游的影響各不相同：

• 可溶性蛋白與蛋白聚集體：可溶性蛋白會拉高總蛋白定量；蛋白聚集體及其他非 EV 顆粒則可能被粒子分析偵測，影響顆粒數與蛋白比值的判讀。
• 脂蛋白：血漿與血清中的脂蛋白 (如: LDL、VLDL、HDL) 在尺寸或密度上與 EV 重疊，單依物理性質難以完全分離，容易干擾 NTA 計數、蛋白體及脂質分析。
• 細胞碎片與凋亡小體：前處理不完整時會混入，影響粒徑分布與蛋白標記判讀。
• 游離核酸與核糖核蛋白複合物：與 Argonaute 蛋白結合的 miRNA 可能和 EV 一起沉澱，讓 EV 來源的 RNA 被高估。

可以依用途排出優先順序：
 

下游用途	優先考量	規劃方向
生物標記探索或診斷研究	批次間一致、可處理多個小體積樣品	可接受中等純度，但流程要標準化，並以對照評估背景訊號
功能試驗 (細胞攝取、訊號傳遞)	純度，避免把可溶性因子的作用歸給 EV	優先去除游離蛋白與培養基成分，並設計去 EV 的對照組
核酸分析 (small RNA-seq、qPCR)	排除非 EV 核酸	考慮搭配 RNase 或蛋白酶處理，確認訊號位於囊泡內
蛋白體學	排除高豐度蛋白	血漿樣品特別需要處理白蛋白與脂蛋白
製程開發	可放大、可重現、可在封閉系統中操作	以切向流過濾、層析等可放大的方法為主，並建立製程中管控點

 

外泌體純化方法怎麼選？從技術原理與優勢

每種方法依靠的物理或生化性質不同，決定了它能去除什麼干擾物、會留下什麼干擾物。下表整理六種常見方法：

方法	分離原理	應用情境	主要優點	常見限制
超速離心 (UC)	依顆粒大小與密度的沉降速率，在高離心力下沉降	細胞培養上清液、中等體積樣品的基礎研究	不需額外試劑，方法歷史長、文獻多	會共同沉降蛋白聚集體與脂蛋白；可能造成囊泡聚集或變形；結果受轉子與操作影響大
密度梯度離心 (DGC)	依浮力密度在碘克沙醇或蔗糖梯度中分層	需要高純度的機制研究、蛋白體學	純度較高，可分離不同密度的次族群	耗時長、通量低、回收較少；需要再移除梯度介質
尺寸排阻層析 (SEC)	依流體力學尺寸，大顆粒先流出、小分子後流出	血漿、血清等小體積樣品；需保留囊泡完整性時	操作溫和，能有效去除游離蛋白，可重複性佳	無法分開粒徑相近的脂蛋白；樣品會被稀釋；上樣體積受管柱規格限制
超濾 (UF)／切向流過濾(TFF)	依分子量截留值 (MWCO) 或孔徑讓小分子通過、截留大顆粒	大體積上清液的濃縮與緩衝液置換	速度快；TFF 可處理公升級體積並連續操作	單獨使用時純度有限；可能發生膜堵塞、吸附與剪切力損傷
沉澱法	以 PEG 等聚合物降低溶解度，使顆粒在低速離心下沉澱	初步篩選、樣品數多、設備有限時	操作簡便、不需超速離心機、回收量高	會共同富集蛋白、脂蛋白與非 EV 核酸；聚合物殘留可能干擾下游分析
免疫親和法	以抗體或配體辨識 CD9、CD63、CD81 等表面標記	特定亞群研究、小體積診斷研究	特異性高，可富集特定來源的 EV	只能取得帶該標記的族群；沖提條件可能影響囊泡完整性；成本較高

 

沒有任何一種方法適用所有樣品。實作前，請依耗材與儀器原廠提供的操作條件設定參數，包括轉子的最大轉速與 k-factor、管柱的上樣體積與流速、膜材的 MWCO 與可承受壓力，以及沉澱試劑的樣品比例。這些條件直接影響回收率與純度結果；MISEV2023亦強調應完整報告分離與濃縮相關參數。不同設備、轉子、管柱或膜材的規格不可直接等同套用，應依實際系統重新評估。 
 

以離心進行外泌體純化時要注意什麼

離心是常見的起點。差速離心 (differential centrifugation) 以逐步提高離心力的方式去除細胞與碎片，適合當作前處理；超速離心可富集小型 EV；密度梯度離心則依浮力密度進一步分離，用來處理與 EV 大小相近、密度不同的干擾物。這些步驟只能得到相對富集的族群，仍可能共同分離非囊泡性顆粒；MISEV2023建議完整記錄轉子、時間、溫度與加減速設定。

操作步驟(僅為文獻常見示例，應視樣品狀態調整)

1. 低速離心去除細胞，常見條件為約 300 × g、10 分鐘。
2. 中速離心去除死細胞與碎片，常見條件為約 2,000 × g、10–20 分鐘。
3. 視需求以約 10,000 × g、30 分鐘左右去除大型 EV，或保留作為另一個分析族群。
4. 以約 100,000–120,000 × g 離心 70 分鐘至 2 小時沉降小型 EV，必要時以 PBS 重懸(Resuspend) 後再離心一次清洗。
5. 需要較高純度時，將沉澱或濃縮液置於碘克沙醇梯度中離心，分段收集後找出富含 EV 標記的區段，再以 SEC、超濾或稀釋後離心移除梯度介質。

必要條件

• 以轉子的 k-factor 換算沉降效率。同樣的 ×g 用在不同轉子上，所需時間不一定相同，更換轉子時要重新計算。
• 離心溫度應固定並完整記錄；EV 分離流程常採低溫操作以降低處理期間的樣品變化，但實際溫度需依樣品與方法驗證。 
• 離心管要平衡，液量需符合轉子與管材的規格，避免管壁變形或樣品外漏。
• 血漿樣品要特別注意血小板去除不完全的問題，血小板在處理過程中活化後會釋出大量 EV，影響結果來源的判斷。

完成確認

• 重懸  (Resuspend) 後若仍有可見團塊或纖維狀物，代表樣品可能存在聚集物或其他共沉降成分，應進一步檢查前處理與分離條件；僅憑外觀無法確認其成分。 
• 比對重懸液與上清液的顆粒數與蛋白量，確認是否有異常損失。
• 密度梯度的各區段應以蛋白標記與顆粒分析確認 EV 集中在預期的密度範圍，文獻中常見約 1.08–1.19 g/mL，實際範圍依梯度介質與樣品而異。

以尺寸排阻或過濾進行外泌體純化時要注意什麼

尺寸排阻層析與超濾、切向流過濾都以尺寸作為分離依據，用途卻不同。SEC 的多孔基質讓小分子進入孔洞、流經較長路徑，EV 通常較早流出，所以能把 EV 和游離蛋白分到不同餾分，適合數百微升到數毫升的樣品；它無法單靠尺寸完全排除粒徑相近的非 EV 顆粒。MISEV2023 將 SEC、超濾與 TFF 分別列為可依目的搭配的分離或濃縮方法。超濾與 TFF 則以膜孔截留顆粒、讓小分子與溶劑通過，主要功能是濃縮與置換緩衝液；TFF 讓液體沿膜面切向流動，比一般離心式超濾更能減少堵塞，可處理數百毫升到公升級的體積。

操作動作

1. 大體積上清液先完成差速離心，必要時依研究是否要保留較大 EV 選擇 0.22–0.45 µm 過濾澄清，再以 TFF 或離心式超濾濃縮到符合 SEC 上樣體積的範圍。
2. 以適當的 MWCO (常見為 100 kDa) 或孔徑規格濃縮，過程中可進行透析過濾 (diafiltration)，把原培養基置換為 PBS 或下游所需的緩衝液。
3. 以緩衝液平衡 SEC 管柱，依規格上樣，分段收集餾分。
4. 以顆粒分析與蛋白定量描繪每個餾分的分布，找出 EV 富集、蛋白較少的區段後合併。
5. 若合併後體積太大，再以低吸附的超濾裝置做最後濃縮。

必要條件

• 依樣品量選擇管柱尺寸，上樣量超過管柱設計範圍時，EV 與蛋白的餾分會重疊。
• 選用低蛋白吸附的膜材，例如再生纖維素或經過處理的 PES，可降低 EV 黏附於膜面造成的損失。
• TFF 要控制跨膜壓 (TMP) 與剪切速率，壓力過高容易形成凝膠層、造成堵塞，也可能破壞囊泡。
• 固定每個餾分的收集體積與編號規則，避免批次間的收集區間偏移。

完成確認

• 可比較各餾分的顆粒數與蛋白量分布，並搭配 EV 相關標記及適合該樣品的非 EV 指標，判斷欲收集的餾分。若顆粒與蛋白分布高度重疊，可再評估上樣量、管柱規格與樣品背景是否影響分離解析度。
• 濃縮前後計算顆粒回收，若損失明顯，檢查膜面吸附與樣品滯留 (dead volume)。
• 重複使用的管柱要以清洗程序與空白上樣確認沒有前一批的殘留，避免餾分交叉污染。
• 若濾液中出現非預期的顆粒訊號，應先排除緩衝液／耗材背景與量測誤差，再檢查膜完整性、膜規格及操作條件。

沉澱與免疫親和外泌體純化適合哪些研究需求

沉澱法以聚合物 (如: PEG) 搶走水分子，降低顆粒溶解度，再以低速離心收集，不需要超速離心機，也適合一次處理大量樣品。它的限制在於選擇性低：蛋白、脂蛋白與游離核酸複合物會一起沉澱，對於需要把效應歸因於 EV 的功能試驗，或追求低背景的蛋白體學，都需要額外純化。

免疫親和法利用磁珠或基材上的抗體捕捉帶特定表面標記的 EV，適合研究特定細胞來源的亞群，例如以組織特異性標記從血液中富集目標 EV。取得的只是帶有該標記的族群，所以結果能代表的範圍要清楚界定。

操作動作

• 沉澱法：樣品完成低速與中速離心澄清後，依試劑比例混合靜置incubation，低速離心收集沉澱並重懸 (Resuspend)；需要較高純度時，再接 SEC 或超濾移除聚合物與游離蛋白。
• 免疫親和法：選定捕捉標記後，將澄清或預先濃縮的樣品與抗體磁珠 incubation，清洗去除非特異結合物，再依下游需求選擇直接在磁珠上裂解分析，或以溫和條件沖提出完整 EV。

必要條件

• 沉澱法要確認殘留的聚合物會不會干擾質譜、粒子分析或細胞實驗，並設計只含試劑、不含樣品的空白對照。
• 免疫親和法要確認標記在目標 EV 上的表現量。CD9、CD63、CD81 在不同細胞來源的表現比例差異很大，只用單一四跨膜蛋白捕捉可能漏掉大量族群。
• 加入同型對照抗體或空白磁珠，評估非特異結合。
• 低 pH 或高鹽等沖提條件可能改變 EV 表面蛋白或完整性，用於功能試驗前要先評估。

完成確認

• 沉澱法產物需檢查非 EV 標記，例如血漿樣品的 APOA1、APOB 與白蛋白，確認共同富集的程度。
• 免疫親和產物應以流過液和捕捉物比對標記分布，確認捕捉效率與特異性。
• 兩種方法都要評估結果是否受到試劑或抗體本身干擾，例如抗體片段在 Western blot 中出現的非特異條帶。

選擇時也要分清楚研究規模。小量樣品的亞群研究重視特異性，免疫親和法較合適；需要大量製備時，沉澱法的純度限制和免疫親和法的成本都不利放大，通常改以 TFF 搭配層析規劃流程。

外泌體純化流程如何建立與確認結果

完整的流程可以拆成四個階段。每個階段只處理一類問題，後續排查時才能快速找出變異來源。

1. 樣品澄清

• 操作動作：依樣品類型進行低速、中速離心或過濾，去除細胞、碎片與大型顆粒。
• 必要條件：血漿前處理應盡量降低血小板及其活化造成的影響，並固定、完整記錄離心條件；尿液可能需處理 Tamm-Horsfall 蛋白 (尿調節素) 形成的網狀結構；細胞培養上清液則需控制培養基與血清來源。若採無血清或 EV-depleted serum 條件，應同時評估其對細胞狀態與 EV 產生的影響，並設置適當培養基對照。
• 完成確認：上清液清澈、沒有可見沉澱，並記錄處理時間與溫度。

2. 濃縮或初步分離

• 操作動作：大體積樣品以 TFF、超濾或超速離心縮小體積；小體積樣品可直接進入分離步驟。
• 必要條件：濃縮倍率要依下一步的上樣條件設定，濃縮過度可能造成顆粒聚集或膜堵塞。
• 完成確認：計算濃縮前後的顆粒回收，確認損失在可接受範圍。

3. 純化

• 操作動作：以 SEC、密度梯度離心或免疫親和法去除主要干擾物，依餾分或區段分析結果決定合併範圍。
• 必要條件：先定義要去除的干擾物，例如游離蛋白、脂蛋白或培養基成分，再選擇能處理該干擾物的方法。
• 完成確認：以顆粒分析、蛋白標記與非 EV 標記確認純化效果。

4. 保存

• 操作動作：分裝成單次使用量，樣品可分裝為單次使用量，以降低反覆凍融；長期保存常採 -80°C，但實際保存條件應依樣品類型、下游用途及穩定性資料建立。
• 必要條件：選用低吸附的管材，並評估保存緩衝液。MISEV2023 提到，以 PBS 加入人血清白蛋白或海藻糖等成分，可能有助於降低保存過程中的損失，但需依下游用途評估添加物是否干擾分析。
• 完成確認：以保存前後的顆粒數與標記比對，確認保存條件造成的變化。

不同生物檢體的背景成分差異很大，前處理要依樣品調整。血漿與血清的主要挑戰是脂蛋白與高豐度蛋白，而且血清在凝血時會由血小板釋出額外 EV，兩者的結果不宜直接比較。尿液的蛋白濃度較低但體積大，且受水分攝取影響，常需以肌酸酐等指標標準化。細胞培養上清液的背景成分主要來自血清與培養基添加物，培養條件一改變，EV 的產量與組成都可能改變。
 

外泌體純化後如何做品質確認

品質確認要同時看四個面向：粒徑與濃度、形態、標記、污染物。只看單一數值容易誤判。例如 NTA 測得較高的顆粒濃度，並不能單獨證明 EV 含量較高，因為部分非 EV 顆粒也可能產生可偵測的散射訊號；因此應搭配形態、蛋白標記及非 EV 成分等互補資訊判讀；MISEV2023 也建議以互補方法描述 EV 製備物及其非 EV 成分。

確認面向	可選用的方法	能回答的問題	限制
粒徑與濃度	奈米顆粒追蹤分析  (NTA)、可調式電阻脈衝感測 (TRPS)、高靈敏度奈米流式細胞儀	顆粒數量與粒徑分布	無法單獨分辨 EV 與同尺寸的非 EV 顆粒；偵測下限依儀器設定而異
形態	穿透式電子顯微鏡 (TEM)、冷凍電子顯微鏡 (cryo-EM)	是否具有囊泡形態、是否有聚集；高解析 cryo-EM 可提供膜結構證據	TEM 負染可能讓囊泡呈杯狀；以少數視野代表整體有抽樣偏差
EV 蛋白標記	Western blot、ELISA、流式分析	是否含有跨膜標記 (CD9、CD63、CD81) 與胞質標記 (TSG101、ALIX、syntenin)	標記表現量依細胞來源而異
污染物與非 EV 成分	Western blot、ELISA、蛋白定量	是否帶有細胞內物質 (calnexin、GM130)、脂蛋白 (APOA1、APOB) 或白蛋白	需依樣品類型選擇合適的負向標記
核酸內容物	RNase 保護試驗、生物分析儀、qPCR	核酸是否位於囊泡內	需搭配清潔劑處理的對照組才能判讀

 

• 空白緩衝液對照：確認緩衝液與耗材本身的背景顆粒。
• 未處理培養基對照：以相同流程處理未接觸細胞的培養基，評估血清或培養基帶入的 EV 與顆粒。
• 細胞裂解液對照：作為蛋白標記的陽性對照，並用來比對細胞內標記的相對含量。
• 去 EV 組分對照：功能試驗中，以純化後的非 EV 餾分或移除 EV 的上清液作比對，確認效應是否來自 EV。

外泌體純化結果不穩定時先檢查哪些環節

批次間顆粒數差很多、標記訊號忽強忽弱，或功能試驗結果無法重現時，建議依以下順序排查：

1. 樣品保存與凍融：確認樣品採集到處理的時間、凍融次數與保存溫度是否一致。血漿樣品多次凍融可能產生顆粒聚集或釋出新的碎片。
2. 前處理：確認離心條件、血小板去除效果、溶血程度與過濾步驟是否一致；細胞培養則確認繼代數、細胞密度、存活率與血清批號。
3. 分離條件：比對轉子型號、離心時間與溫度、管柱上樣體積、餾分收集區間、TFF 跨膜壓等參數。
4. 耗材相容性：確認管材、膜材與管柱的批號與材質，低吸附處理不同的耗材可能造成明顯的回收差異；新批號的耗材可先以同一樣品做平行測試。
5. 量測設定：確認粒子分析的稀釋倍數是否落在線性範圍、偵測閾值是否一致，以及蛋白定量方法是否受緩衝液或殘留試劑干擾。

定位變異時，要用同一批次的對照樣品與完整操作紀錄比對。可以準備一份分裝好的參考樣品，例如同一批細胞培養上清液，每次純化時一起處理，用它判斷變異來自樣品還是流程。一次只調整一個條件並記錄結果；在原因確認之前同時更換離心條件、耗材與量測設定，就無法判斷哪個改變真正有效，也可能引入新的變異。
 

外泌體純化常見問題

外泌體純化是否需要搭配兩種以上的方法

多數情況下，多步驟組合可利用不同分離原理降低特定共分離成分，例如先濃縮再進行 SEC，或依研究目的結合尺寸與密度等不同分離策略；但脂蛋白與 EV 的物理性質可能重疊，仍需以適當的非 EV 指標確認去除效果。步驟越多，損失與操作變異也越多，所以不要為了增加步驟而犧牲回收率或再現性。每加一個步驟之前，先定義它要去除哪一種干擾物、用什麼指標確認已經去除，例如以 APOB 訊號下降確認脂蛋白減少；無法定義時，這個步驟可能沒有必要。
 

外泌體純化可以直接用於臨床治療嗎

台灣尚無核准外泌體用於臨床治療。研究用純化流程的目的是取得可分析、可重現的研究材料，不能直接視為可供人體使用的治療產品。人體研究與臨床開發須依食藥署《人類胞外體製劑臨床試驗申請指引》準備品質、非臨床、安全性與臨床試驗資料；官方公開資料也指出，台灣尚無核准可供臨床常規治療的外泌體藥品。外泌體作為化粧品原料的個案審查與醫療用途是不同制度，研究結果不應延伸為療效或安全性的承諾。涉及人體用途時，請依主管機關最新公告與合格醫療專業人員的意見評估。

外泌體純化的成敗，多半在樣品條件、下游用途與品質指標定義清楚的時候就決定了。若正在規劃 EV 研究，可以先整理樣品來源與體積、預計的下游分析，以及目前可用的設備與預算，
圖爾思生技的外泌體檢測/純化服務可依血清、血漿或細胞培養液的樣本特性、處理體積與研究需求，協助研究團隊評估分離方法與後續表徵規劃。
 

引用連結、參考連結

• Minimal information for studies of extracellular vesicles (MISEV2023): From basic to advanced approaches – PubMed
• MISEV2023 provides an updated and key reference for researchers studying the basic biology and applications of extracellular vesicles – PMC
• Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles (MISEV): Ten-Year Evolution (2014–2023) – PMC
• 外泌體夯 衛福部：未核准治療行為、別輕信療效｜中央社 CNA
• 衛生福利部食品藥物管理署：申請源自人體細胞之外泌體使用於化粧品之個案審查應檢送文件
• 人類胞外體製劑臨床試驗申請指引｜衛生福利部食品藥物管理署：用於確認人體研究與臨床開發資料要求。
• 圖爾思生技外泌體檢測／純化服務