組織包埋切片染色(IHC)實驗最佳化 Section1

圖爾思技術服務中心一直是組織包埋切片染色(IHC)技術服務的專業委外廠商，我們於此領域的經驗相當豐富，博士級的團隊能提供全方位的IHC解決方案，也是各大研究單位與生技公司的最佳合作夥伴。今天我們會為大家探索IHC實驗中常遇到的問題的解決方案：

1. IHC染色效果不佳：在IHC染色實驗中，抗體的品質絕對是影響染色效果最重要的因素，因此如何挑選一支適合IHC染色的抗體就變得非常重要，通常選擇免疫原為蛋白質的抗體最能提供染色的最佳化品質，除此之外，您也可以在抗體的產品說明中確認此抗體是否經過原廠的IHC認證，若此抗體的原廠品質測試樣品甚至和您的相同，這樣的抗體絕對是首選。因此，抗體的品牌並不重要，重要的是抗體的免疫原種類與原廠的IHC染色品質測試。

2. IHC染色結果背景值過深：通常產生此結果的原因為抗體和樣品作用(incubation)的時間過長，或是抗體的濃度過高，而多株抗體通常較單株抗體也容易造成背景值較深的問題(此因素隨著抗體技術的演進以並非絕對)，另外，若過氧化氫脢(peroxidase)去除不乾淨、實驗過程中wash的步驟若做的不確實或是wash的時間不夠導致二抗、DAB等一些substrate殘留過多也是造成背景值過深的因素。

3. 如何挑選適合的固定液：一般而言我們最常用4%PFA或是福馬林當成固定液 ; 但若是皮膚組織我們則建議使用Bouin進行固定，因為Bouin較容易軟化皮膚組織，後續進行切片時可以得到較好的切片效果 ; 若是後續想要偵測醣類蛋白質則建議使用FAA作為固定液。

4. 為何要去除內源性過氧化脢 (peroxidase)？因為內源性的過氧化脢容易影響DAB的呈色而造成偽陽性的訊號產生，因此這個步驟對於染色結果是一個很重要的步驟。

5. 組織切片的最佳厚度為何？我們建議切片的厚度最佳為4um，因為單層細胞的厚度大約為5um，而切片4um可以確保切片為單層細胞，多層細胞會造成後續的判讀困難或是誤判，因此切片厚度4um可以確保染色後判讀的正確性。

6. 通常同一個組織建議的切片片數是多少？我們建議一組切五片，因為數量太多的話會導致樣品間型態上的差異過大，而過少的話後續的染色測試條件就不能完全。

7. 無訊號或訊號弱 : 通常原因是抗體親和力不高，或是retrieval的條件不適當。解決方式是增加實
驗中抗體濃度與結合時間，或是增長呈色時間，或是嘗試不同retrival條件。另外建議實驗時要帶有一片positive control片，即預期會有表現的組織切片，以排除是實驗組切片本身就無表現或低表現的因素。

8. 訊號位置不正確 : 例如已知是在細胞質表現的蛋白，染色後發現只在細胞核表現，此情形通常
是抗體專一性的問題，這時若positive control片也是相同結果即表示此抗體不專一，也就是不適用於此組織免疫染色實驗，此時應更換抗體。

 
以上文章由圖爾思技術服務中心與長庚大學病理實驗室共同撰寫。
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