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16 2022.12

BIOTOOLS檔案_平台也會挑物種 !? 都是 DNA 差在哪裡?

     原創文章     引用請註明出處  
 

▌案件大綱
 

  • 品項: Whole Genome Sequencing
     
  • 定序平台: Oxford Nanopore Technologies PromethION
     
  • 樣品物種/類型: 鳥類 DNA
     
  • 欲解決案件難題: 案主希望進行鳥類基因體的發表,因此委託圖爾思進行三代定序,雖然準備的樣品 DNA 完整度很好,但是一開始定序產出不盡理想。
     
  • 解方: 經廣泛搜尋相關研究的實驗方法與數據產出,以及 Nanopore Community 分享的經驗,優化實驗流程後取得足夠分析使用的數據量,定序長度案主也很滿意。
     

▌案件詳述
 

三代定序的發展,大幅降低組裝基因體的難度,讓科學家們得以一窺不同生物基因體的奧秘。從脊索動物從水生演化成陸生的重要基因變化,到作物提高產量、提高風味,以及提高抗病的重要基因,透過三代定序得以逐一完成。三代定序平台各有其優點,有時會耳聞某些物種在特定的定序平台產出不理想,但是當遇到這個情況時,我們又可以如何解決呢?

 

本次案件分享的案主是研究鳥類的專家,曾經使用二代定序組裝鳥類基因體,但是平台的特性使得組裝基因體連續性不佳,因此在圖爾思介紹下決定嘗試三代定序,並且對於 Nanopore 沒有長度限制的定序特性欣然嚮往。

 

在一開始的樣本準備中,客戶萃取的 DNA 雖然完成性不錯,但是經過品質檢定可觀察到一定比例的小片段 DNA,雖然客戶重新萃取了多次 DNA,都有觀察到小片段 DNA 殘留的狀況,在與客戶溝通後決定委託圖爾思去除,主要是為了提高平均定序長度。

 

當 HMW DNA 準備完畢,進行第一次的定序時,實驗人員卻發現晶片的可定序奈米孔數量快速下降,產出少量的數據即沒有回應,看著奈米孔數量下降卻無能為力的情況,實驗人員回想起來覺得害怕極了。

 

經過 FAS 與客戶確認 DNA 萃取的試劑與流程,沒發現任何影響奈米孔活性的不純物殘留的可能性,排除了多醣類或者是有機溶劑殘留的情況。因此搜尋相關研究的文獻,以及其他 Nanopore 使用者分享的寶貴經驗,發現存在所謂的 “ 雞血問題”,來自雞血萃取的 DNA 會快速的堵塞奈米孔,並且嚴重的降低數據產出,發生原因目前並沒有很好的解釋方法,只將這類型樣品稱呼為 “ 塞孔 DNA” (blocky DNA),由於實驗物種也是鳥類,推測可能遇到相同原因而產出不佳。

 

為了避免嚴重的塞孔狀況,建議客戶更改萃取 DNA 的組織,實驗人員也參考 Nanopore Community 分享的經驗優化定序步驟。經過不懈的努力,重新定序的時間延長超過 2 倍,數據產出提高超過 3 倍,讀長 N50 達到 20 kb,並且有多條序列長度超過 100 kb,最長序列甚至超過 500 kb,各項指標與已發表文獻相比毫不遜色。

 

您也有樣本想進行基因體發表嗎? 是否因為物種特殊而猶豫不前? 快聯繫圖爾思,了解更多三代定序的解決方案。

 

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圖爾思生物科技 / 微生物體研究中心
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