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2023.06
ddRAD-seq 定序古拳法 -人人皆能成為成本效益大師
ddRAD (Double Digest Restriction Associated DNA) - 從案件評估、建庫、定序到分子標誌。
對於進行遺傳多樣性研究、 QTL mapping、GWAS 等等的研究人員而言,在取得合適的研究族群後,所面臨的問題將是如何大規模且有效的取得變異位點。
在定序價格持續下降的現在,以全基因體定序 (Whole genome sequencing, WGS) 定序整個物種基因體不再昂貴,但對於樣品數動輒上百的遺傳研究仍是一筆可觀的費用,同時 WGS 技術產出的大量序列,在分析和數據儲存上可能會耗費許多不必要的資源。因此簡化基因體定序 (Reduced-representation sequencing, RRS) 仍然有經濟和快速的優勢。
簡化基因體定序技術包含 RRL (Reduced-Representation Library)、RADseq (Restriction-site Associated DNA sequencing)、GBS (Genotyping by sequencing) 等不同建庫方法,可適用於無參考序列的物種。建庫後僅定序特定切位旁固定長度的片段,被定序的部分常為該物種全基因體的 5% 或是更少。
圖爾思提供 ddRAD (Double Digest Restriction Associated DNA) 建庫方法 (Peterson et al., 2012),使用兩個限制酶 (Restriction Enzyme) 進行酶切,並搭配片段篩選 (Size selection) 進行基因體簡化,可以穩定控制定序片段區域,且可根據需求更換限制酶組合,給予建庫流程更多彈性(圖一)。
![](//www.toolsbiotech.com/archive/images/editor/news/418/a73a3b2553a5e70b.png)
圖一、不同應用所需分子標誌數量與 genotyping 策略 (Peterson et al., 2012)
在案件評估階段,針對有參考序列的物種,可使用圖爾思自建 Biotools ddRAD 雲平台進行序列切位模擬,目前平台提供 11 個物種參考序列和 106 組常用限制酶模擬(圖二)。
![](//www.toolsbiotech.com/archive/images/editor/news/418/d000705697d4a722.png)
圖二、Biotools ddRAD 雲平台介面
in silico 切位模擬介面可以選擇限制酶 Rare Cutter (Enzyme A)、Common Cutter (Enzyme B)、以及 size seletion 範圍,即可得到以參考序列模擬,以兩端切位命名的 AA、AB 和 BB 片段,評估實驗條件的重點如下:
![](//www.toolsbiotech.com/archive/images/editor/news/418/e8167b04008888a8.png)
圖三、Biotools ddRAD 雲平台切位模擬介面
實際案例分享:
以下是某物種參考過去文獻所挑出的數個限制酶組合,以雲平台所做出的切位模擬結果。
考量 AB 片段數量以及 AA/AB ratio,最終選擇 TaqI+PstI 和 TaqI+EcoRI 進行前測試。
表一、限制酶組合模擬結果
![](//www.toolsbiotech.com/archive/images/editor/news/418/09f6ec246c08adb7.png)
前測試選擇兩個親緣關係較遠的個體,以 TaqI+PstI 和 TaqI+EcoRI 限制酶組合進行建庫,分別得到 13,739 和 12,431 個同質多型性位點。
由於該物種的參考序列與實際樣品親緣較遠,且相對較不完整,模擬的正確度可能會受到影響,因此將實際定序序列比對回模擬結果,發現 TaqI+PstI 這個限制酶組合較符合模擬結果。
表二、實際序列比對模擬結果
![](//www.toolsbiotech.com/archive/images/editor/news/418/6ce458c539805b3d.png)
案件流程:
![](//www.toolsbiotech.com/archive/images/editor/news/418/194e335f7142a1db.png)
圖三、ddRAD 案件流程
樣品收件標準:
![](//www.toolsbiotech.com/archive/images/editor/news/418/9703106e3cb8fba1.png)
參考資料:
B.K. Peterson, et al., Double digest RADseq: an inexpensive method for de novo SNP discovery and genotyping in model and non-model species, 2012/05/31 edn, PLoS One 7 (5) (2012)
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對於進行遺傳多樣性研究、 QTL mapping、GWAS 等等的研究人員而言,在取得合適的研究族群後,所面臨的問題將是如何大規模且有效的取得變異位點。
在定序價格持續下降的現在,以全基因體定序 (Whole genome sequencing, WGS) 定序整個物種基因體不再昂貴,但對於樣品數動輒上百的遺傳研究仍是一筆可觀的費用,同時 WGS 技術產出的大量序列,在分析和數據儲存上可能會耗費許多不必要的資源。因此簡化基因體定序 (Reduced-representation sequencing, RRS) 仍然有經濟和快速的優勢。
簡化基因體定序技術包含 RRL (Reduced-Representation Library)、RADseq (Restriction-site Associated DNA sequencing)、GBS (Genotyping by sequencing) 等不同建庫方法,可適用於無參考序列的物種。建庫後僅定序特定切位旁固定長度的片段,被定序的部分常為該物種全基因體的 5% 或是更少。
圖爾思提供 ddRAD (Double Digest Restriction Associated DNA) 建庫方法 (Peterson et al., 2012),使用兩個限制酶 (Restriction Enzyme) 進行酶切,並搭配片段篩選 (Size selection) 進行基因體簡化,可以穩定控制定序片段區域,且可根據需求更換限制酶組合,給予建庫流程更多彈性(圖一)。
![](http://www.toolsbiotech.com/archive/images/editor/news/418/a73a3b2553a5e70b.png)
圖一、不同應用所需分子標誌數量與 genotyping 策略 (Peterson et al., 2012)
在案件評估階段,針對有參考序列的物種,可使用圖爾思自建 Biotools ddRAD 雲平台進行序列切位模擬,目前平台提供 11 個物種參考序列和 106 組常用限制酶模擬(圖二)。
![](http://www.toolsbiotech.com/archive/images/editor/news/418/d000705697d4a722.png)
圖二、Biotools ddRAD 雲平台介面
- AB 片段數量 -> AB 片段為定序目標,可依據族群結構和後續應用調整所需片段數量
- AA/AB ratio -> 越低越好,AA 序列不會被定序,但會影響建庫定量結果
- 限制酶價格 -> 選用單價較低的限制酶可節省建庫成本
![](http://www.toolsbiotech.com/archive/images/editor/news/418/e8167b04008888a8.png)
圖三、Biotools ddRAD 雲平台切位模擬介面
實際案例分享:
以下是某物種參考過去文獻所挑出的數個限制酶組合,以雲平台所做出的切位模擬結果。
考量 AB 片段數量以及 AA/AB ratio,最終選擇 TaqI+PstI 和 TaqI+EcoRI 進行前測試。
表一、限制酶組合模擬結果
![](http://www.toolsbiotech.com/archive/images/editor/news/418/09f6ec246c08adb7.png)
前測試選擇兩個親緣關係較遠的個體,以 TaqI+PstI 和 TaqI+EcoRI 限制酶組合進行建庫,分別得到 13,739 和 12,431 個同質多型性位點。
由於該物種的參考序列與實際樣品親緣較遠,且相對較不完整,模擬的正確度可能會受到影響,因此將實際定序序列比對回模擬結果,發現 TaqI+PstI 這個限制酶組合較符合模擬結果。
表二、實際序列比對模擬結果
![](http://www.toolsbiotech.com/archive/images/editor/news/418/6ce458c539805b3d.png)
案件流程:
- ddRAD 案件屬特殊案件,請先與專員討論實驗設計以及相關資訊。
- 若實驗物種有參考序列,可評估是否可進行切位模擬。
- 首次進行 ddRAD 建庫,建議先以少量樣品進行前測試。
- 除 Variant calling 之外的分析皆屬客製化分析,有相關需求請與專員詳談。
![](http://www.toolsbiotech.com/archive/images/editor/news/418/194e335f7142a1db.png)
圖三、ddRAD 案件流程
樣品收件標準:
- High Molecular Weight Genomic DNA, HMW DNA ≧ 1000 ng
- DNA 濃度 ≧ 20 ng/ ul (Qubit測定)
- 樣品體積 ≧ 50 ul
- 樣本必須要有完整 Genome片段(主片段,如下圖 6-10號樣本)
建議主要DNA片段 ≧ 10 kb - OD260/OD280 = 1.8-2.0
- OD260/OD230 ≧ 2.0
![](http://www.toolsbiotech.com/archive/images/editor/news/418/9703106e3cb8fba1.png)
參考資料:
B.K. Peterson, et al., Double digest RADseq: an inexpensive method for de novo SNP discovery and genotyping in model and non-model species, 2012/05/31 edn, PLoS One 7 (5) (2012)