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2026．04
外泌體凍存的成功關鍵：為何「程序降溫速率」優於「極低溫儲存」？
外泌體凍存的成功關鍵：為何「程序降溫速率」優於「極低溫儲存」？
Fig 1. 外泌體的顆粒濃度與結構完整性易受環境影響。無論是存放於 4°C 或室溫環境，或不當的降溫速率進行凍存，均是導致外泌體品質劣化的關鍵因素。
▌為什麼『降溫速率』是成功的決定性因素？
Fig 2. 當溫度降至 - 47°C 以下時，細胞內的脫水過程趨向停止，剩餘的水分會進入玻璃態（glass transition）。這意味著在此溫度以下，樣本對於「快速降溫」的耐受度大幅提高。
在細胞冷凍保存過程中，確切的最低降溫溫度雖視細胞類型而異，但多項研究指出，- 60°C 常被視為大多數細胞完成受控降溫後的實務安全轉移點（Fig 2.）。
當樣本降至 - 60°C 以下時，大部分的細胞代謝活動已趨於停止，且細胞內的冰晶結構進入穩定狀態，此時採取快速降溫（如直接轉移）並不會對細胞造成額外損傷。因此，在完成受控降溫程序後，樣本可直接從 - 60°C 環境轉移至長期儲存冰箱或液氮系統中，以確保生物樣本的長期穩定性與活性回收。
Fig 3. Liver spheroid (ELS) 以 12% DMSO 混合 Viaspan 作為冷凍保護劑，使用 VIA Freeze 以 0.3°C/min 的降溫速率至指定溫度，隨後轉移至液態氮中低溫保存。實驗結果顯示，當可調控降溫程序執行至 - 40°C 以下再行浸入液態氮時，各組樣本解凍後的細胞活力均無顯著差異。
而外泌體的保存條件也會影響其濃度、結構完整性與下游功能。- 80°C 通常被視為相對穩定的儲存條件，但若冷凍與解凍過程缺乏良好控管，仍可能導致囊泡聚集、膜結構受損或功能下降。對於外泌體而言，穩定、可重現的降溫過程，是確保顆粒完整性、內容物保留與功能一致性的核心。
▌使用 VIA FreezeTM 免液態氮程序降溫儀，能為外泌體提供最穩健的冷凍保存：
了解更多：VIA Freeze™ 免液態氮程序降溫儀
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▌外泌體研究面臨的保存挑戰
外泌體（Exosome）在生物標誌物開發與新興療法中扮演關鍵角色。然而，外泌體的結構脆弱，對環境變化較為敏感。根據研究顯示，非凍存狀態（ 4℃ 或室溫）會導致外泌體數量快速流失、發生融合與聚集，造成關鍵內容物（如 miRNA 與蛋白質）的降解；而降溫速率過快或不適合，會導致外泌體內水分滲透不及，殘留水分在囊泡內形成冰晶結構，造成機械性損傷（Mechanical Damage），造成囊泡膜破裂或形變，進而影響其完整性與功能（如 Fig 1.）。
Fig 1. 外泌體的顆粒濃度與結構完整性易受環境影響。無論是存放於 4°C 或室溫環境，或不當的降溫速率進行凍存，均是導致外泌體品質劣化的關鍵因素。▌為什麼『降溫速率』是成功的決定性因素？
冷凍保存不僅僅是達到極低溫，關鍵在於『如何降溫』。
- 物理層面：可調控的降溫速率（Controlled-rate freezing）可將細胞外冰晶生長控制在安全範圍內。冷卻太慢會導致溶液毒性損傷，冷卻太快則會因水分來不及排出而產生致死性的胞內冰晶。對於外泌體而言，降溫速率過快或過慢都可能導致冰晶形成失衡，進而損傷外泌體結構。受控降溫可確保冰晶在安全條件下形成。
- 生物層面：不當的凍存過程會破壞囊泡膜結構，導致內容物洩漏與表面標誌蛋白（如 CD63, CD81, CD9）的喪失，改變囊泡的功能。
Fig 2. 當溫度降至 - 47°C 以下時，細胞內的脫水過程趨向停止，剩餘的水分會進入玻璃態（glass transition）。這意味著在此溫度以下，樣本對於「快速降溫」的耐受度大幅提高。在細胞冷凍保存過程中，確切的最低降溫溫度雖視細胞類型而異，但多項研究指出，- 60°C 常被視為大多數細胞完成受控降溫後的實務安全轉移點（Fig 2.）。
當樣本降至 - 60°C 以下時，大部分的細胞代謝活動已趨於停止，且細胞內的冰晶結構進入穩定狀態，此時採取快速降溫（如直接轉移）並不會對細胞造成額外損傷。因此，在完成受控降溫程序後，樣本可直接從 - 60°C 環境轉移至長期儲存冰箱或液氮系統中，以確保生物樣本的長期穩定性與活性回收。
▌控管 - 60℃以上的降溫過程，以優化解凍後的細胞活性與功能
Fig 3. Liver spheroid (ELS) 以 12% DMSO 混合 Viaspan 作為冷凍保護劑，使用 VIA Freeze 以 0.3°C/min 的降溫速率至指定溫度，隨後轉移至液態氮中低溫保存。實驗結果顯示，當可調控降溫程序執行至 - 40°C 以下再行浸入液態氮時，各組樣本解凍後的細胞活力均無顯著差異。而外泌體的保存條件也會影響其濃度、結構完整性與下游功能。- 80°C 通常被視為相對穩定的儲存條件，但若冷凍與解凍過程缺乏良好控管，仍可能導致囊泡聚集、膜結構受損或功能下降。對於外泌體而言，穩定、可重現的降溫過程，是確保顆粒完整性、內容物保留與功能一致性的核心。
▌使用 VIA FreezeTM 免液態氮程序降溫儀，能為外泌體提供最穩健的冷凍保存：
- 標準化曲線：建立並執行可調控的降溫曲線（或針對外泌體優化降溫速率）。
- 添加保護劑：搭配海藻糖（Trehalose）、蔗糖（Sucrose）或 DMSO 等凍存劑以調節冰核動力學。
- 合規與一致性：VIA Freeze™ 採用的傳導冷卻金屬可消除傳統 LN2 系統中常見的批次間差異，滿足全球監管機構（如 FDA, EMA）對先進療法產品「一致性」與「效價」的嚴格要求 。
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▌參考文獻
- Meneghel J, Kilbride P, Morris JG, Fonseca F (2019). Physical events occurring during the cryopreservation of immortalized human T cells. PLoS ONE 14(5): e0217304.
- P. Kilbride. Experimental and mathematical modelling of the culture and cryopreservation of a bioartificial liver device utilizing a 3D cell scaffold construction. Diss. University College London (UCL) 2016.
- Wu, J.-Y., Li, Y.-J., Hu, X.-B., Huang, S., & Xiang, D.-X. (2021). Preservation of small extracellular vesicles for functional analysis and therapeutic applications: A comparative evaluation of storage conditions. Drug Delivery, 28 (1), 162–170.
