突破 mRNA 製程瓶頸：BioLector XT 補料分批策略實現高效率、低成本 IVT 製程｜圖爾思生技

 

一、前言

RNA 的生產通常透過體外轉錄（In Vitro Transcription, IVT）進行：這是利用線性 DNA 模板與聚合酶，以核苷三磷酸（NTPs）為原料，透過酵素合成 RNA 的無細胞培養過程。IVT（特別是共轉錄加帽時）目前仍是 RNA 製造中成本最高昂的步驟，這對 RNA 療法（例如 mRNA 疫苗）的普及構成了挑戰。傳統上 IVT 是以「分批（Batch）」製程進行，反應會持續到反應物耗盡為止。然而，某些 IVT 反應物在高濃度下會抑制反應，進而限制了 mRNA 的產量。

本研究利用 Beckman Coulter 的 BioLector XT 高通量自動微生物反應器，來提升 IVT 反應的產量與效率。該系統具備 48 個培養孔，能即時監測 pH 值、溶氧（DO）與螢光。研究證實，BioLector XT 能應用於「無細胞（Cell-free）」的 IVT 製程，透過補料分批（Fed-Batch）策略，精準調控 NTP 與鎂離子的補料速率，高效產出 mRNA 並提升原料利用率。此外，研究發現 pH 值與 mRNA 粗濃度具有高度線性相關，可作為即時反應進度的關鍵指標。

我們在 BioLector XT 上開發出的製程，成功放大至 ReadyToProcess WAVE™ 25 波浪生物反應器中；後者是一款符合 GMP 規範、具泵浦、即時 pH 與溶氧（DO）監測功能的封閉系統。在本研究中，首先於 BioLector XT 中以 0.8 mL 的微量規模完成製程優化開發，隨後將該條件線性放大至 WAVE™ 25 反應器中的 20 mL 及 200 mL 的培養規模。

 

二、材料與方法

• 補料控制： 針對核苷三磷酸（NTPs）與鎂離子 (Mg²⁺) 混合物篩選最佳補料速率與濃度。
• 即時監控： 自動即時監測 pH 值、DO、螢光等關鍵指標，無需人工取樣。

  (A) 配備閥門氣體控制單元的 BioLector XT 高通量自動微生物反應器，實現精準的補料控制。
  (B) BioLector XT 所使用的微流道微孔盤。該孔盤包含 32 個培養孔，以及 16 個補料試劑的儲液孔（Reservoir wells）。

● WAVE™ 25 波浪生物反應器（規模放大）： 將 BioLector XT 篩選出的最佳參數，線性放大至 20 mL 與 200 mL 的 GMP 等級封閉系統中生產。

 

分析

所有體外轉錄反應的分析均使用氯化鋰（LiCl）沉澱法純化的樣品進行了分析。mRNA 粗濃度是以分光光度測量，用於產量計算；產量的定義為產生的 RNA 總質量除以反應體積（若為補料分批製程，則以初始體積計算）。利用毛細管電泳 Agilent 4150 TapeStation 測量 RNA 樣品的完整度（Integrity），其定義為主峰面積與總面積之比。dsRNA 含量則使用 J2 免疫斑點法（immunoblot assay）進行測量，並以一段 142 鹼基對 (bp) 的 dsRNA 作為對照標準。

為了測定蛋白質表達量（Potency），純化後的 mRNA 樣品使用牛痘病毒加帽酶（vaccinia capping enzyme）與 2’-O-甲基轉移酶進行轉錄後加帽。樣品經由第二次 LiCl 沉澱純化後，使用 jetMESSENGER 轉染試劑轉染至 HEK 293 細胞。轉染 24 小時後，透過流式細胞儀測定 GFP 陽性細胞的百分比。

詳細材料與方法請參閱 Cytiva 官網連結
 

三、結果與討論

IVT 初始條件 DoE

本研究採用 Central Composite Design, CCD 進行實驗設計（DoE），目的在優化體外轉錄初始階段之 NTP（6 - 10 mM）與 Mg²⁺ （35 - 70 mM）濃度。分析顯示，提高初始 NTP 濃度會顯著降低轉錄速率，可能是過量鹽離子干擾聚合酶與 DNA 的結合。Mg²⁺ 濃度則與 RNA 合成速率呈拋物線相關，其最佳值取決於 NTP 濃度，且 Mg²⁺ 與總 NTP 比須維持於 1 以上以確保反應效率 (Fig. 1)。基於上述特徵，採用補料分批（Fed-Batch）策略可有效緩解初始高 NTP 濃度引起抑制，同時避免後期反應物耗盡，是提升 mRNA 產量的關鍵方法。

Fig.1 mRNA 合成初始速率之 DoE 研究。此模型等高線圖（R2: 0.98, p < 0.05）由 DoE 研究生成，顯示前 30 分鐘內 Mg2+ 與 NTP 對初始反應速率（mg of RNA per mL of reaction volume per h）的影響，該速率透過 LiCl 純化樣品於 260 nm 之吸光值（A260）測定。顯著模型項包括：Mg²⁺、Mg²⁺*NTP 及 Mg²⁺*Mg²⁺。黑點表示實驗測試條件。各核苷酸之 NTP 濃度為等莫耳比，總 NTP 濃度為圖示數值的 4 倍。
 

Fed-Batch IVT 技術開發

基於 DoE 優化結果，設定 52.5 mM Mg²⁺ 與 6 mM NTP 為初始反應條件，並透過 BioLector XT 評估不同補料策略對 mRNA 產量的影響。補料液由 50 mM Mg²⁺ 及等莫耳 NTPs 組成，目的在及時補充 NTPs 以及維持 Mg²⁺ 濃度，同時規避轉錄抑制。透過系統內建軟體，測試了恆定、線性及指數衰減等補料模式 (Fig.2)。結果顯示，補料分批（Fed-Batch）製程之 mRNA 產量提升至 13.7–15.5 mg/mL，相較於傳統分批（Batch）反應，在產量與反應效率上均呈現顯著差異。

Fig. 2 不同補料策略下 IVT 產量的比較。(A) 使用多種補料配置的補料分批 IVT 反應 mRNA 產量（mg per initial reaction volume）。以 85 µL/h 的恆定速率補料達到最高產量（15.5 mg/mL），其餘策略（包括延遲 0.5 小時啟動、補料時長 5 小時、指數衰減、增加補料速率至 100 µL/h 以及線性增加）所得產量相似或略低。(B) 折線圖說明各實驗條件下隨時間變化之補料速率配置。

針對 Fed-Batch IVT 製程進行一系列參數優化，為平衡產量、進料體積與 NTP 的利用率 (Fig .3)。研究顯示，採用 85 μL/h 恆定速率補料可獲得最高產量（15.5 mg/mL）；然而，當補料速率進一步提升至 100 μL/h 時，產量反而略降至 15.2 mg/mL。此結果表明 NTPs 並非此階段影響產量的因素，且過量補料所導致的鹽類堆積可能抑制轉錄反應。在 85 μL/h 的條件下，NTPs 使用效率僅約 50%–55%。

在所有測試的補料條件下，估算的總體 NTPs 利用率均低於 60%，效率低下的主因在於使用等莫耳濃度的核苷酸補料，且核苷酸消耗速率不平衡造成；由於 mRNA 結構中包含 poly(A) 尾端，使得 ATP 的利用比例最高，而其他核苷酸的利用率則相對較低。以 85 μL/h 恆定補料條件為例，我們估計總 ATP 的消耗率約為 85%，而鳥苷三磷酸 (GTP)、胞苷三磷酸 (CTP) 及尿苷三磷酸 (UTP) 的利用率均低於 55%，其中以 UTP 最低，僅為 35%。

為進一步優化核苷酸利用率，本研究評估了六種補料策略及兩種補料配方對 NTPs 併入效率之影響（Fig. 3）。所有實驗條件均以 85% 總體利用率為目標，重點在於提升 GTP、CTP 與 UTP 之利用。

● 補料配方 1：調整了補料濃度，確保各項 NTPs 之總供應量（即初始量加上以 85 μL/h 補料 6 小時之總量）與 mRNA 序列頻率成正比。如圖 3 所示，此策略達到了 83% 的利用率；相較之下，提前 1 小時停止補料或採用指數衰減補料，其產量均下降至 12.9 mg/mL，且未觀察到效率提升。

● 補料配方 2：則為簡單比例組成，補料液中的 NTPs 濃度直接與 mRNA 序列成正比。若採用配方 1 的指數衰減策略，產量雖達 15.2 mg/mL，但因過度補料導致利用率僅 66%。隨後研究嘗試了另外兩種指數衰減策略，目的使補料速率盡可能貼合反應動力學下的 NTPs 消耗速率。由於反應初期 mRNA 合成速率最高，需較高之初始補料速率，甚至超出了系統限制，因此實驗採行「兩段式」設計：除了持續 6 小時的指數衰減補料外，前 2 小時由第二儲液槽額外提供 13.82 μL/h 之恆定補料。此類策略（兩段式指數衰減，以及具 1 小時初始延遲之兩段式指數衰減）之最終產量分別為 15.1 與 15.4 mg/mL，將利用率提升至 70% 與 75%。
 

Fig. 3 補料策略對 NTPs 效率的影響。(A) 使用六種不同 NTPs 補料策略（分為 NTPs 補料配方 1 與 2 兩組）的 IVT 反應 mRNA 產量（mg per initial reaction volume)）比較。前三組條件（配方 1）考慮了初始與補加的 NTPs 總量；後三組條件（配方 2）依據序列比例的補料速率，且未針對初始 NTPs 濃度進行調整。所有 IVT 之各項 NTPs 初始濃度均為 6 mM。(B) 折線圖顯示各策略的補料速率隨時間的變化曲線。NTPs 利用率範圍介於 66% 至 84%，根據 mRNA 產量、NTPs 總補料量及 mRNA 序列估算而得。

總結而言，精準的原料組成與動態補料策略是實現高效 IVT 製程的關鍵。雖然部分單次試驗結果具初步趨勢意義，但已明確證實結合序列特徵與反應動力學的補料策略，能顯著改善產量並降低原料成本。

擴大實驗

本研究將 BioLector XT（0.8 mL）開發之恆定補料策略，按體積比例線性放大至 WAVE™ 25（20 及 200 mL）。結果顯示，各規模之產量曲線高度趨同 (Fig. 4)，且 mRNA 完整度、dsRNA 含量及體外效力等品質指標均具高度可比性 (Table 1 & Fig. 5)，並與傳統分批製程相當。

Fig.4 於三種規模下進行的補料分批 IVT 反應，mRNA 產量時程比較：分別為 0.8 mL（BioLector XT），以及 20 mL 與 200 mL（ReadyToProcess WAVE™ 25）。所有實驗條件均採用恆定補料策略。

Table 1. 不同培養規模和 BioLector XT 在 IVT 反應的 mRNA 品質比較



Fig. 5  In vitro 效力數據。使用 BioLector XT 與 WAVE™ 25，在 0.8 mL 至 200 mL 規模下，透過 Batch 與 Fed-Batch 方法生產之 mRNA 處理後的 HEK 293 細胞，所進行的流式細胞分析。

此成功案例證實了比例補料原則在 IVT 製程轉化中的穩健性，微量開發有效銜接工業生產規模，為後續製程強化與自動化奠定基礎。

pH 值相關性

本研究利用 BioLector XT 與 WAVE™ 25 進行線上監測，分析 Fed-Batch IVT 反應。結果顯示，兩系統在恆定補料下的 pH 值下降趨勢一致（約 -0.76 至 -0.86），證實於不同規模製程間具備穩定性與可放大性。數據指出，mRNA 粗濃度與 pH 值呈現顯著線性相關（R2 = 0.9765），證實 pH 值可作為反應進度之即時監測指標。為開發「動態 pH 關聯補料配置」提供了研究基礎，有助於精確調控反應動力學並極大化產率。

Fig. 6 Fed-Batch IVT 在不同培養規模的 pH 值曲線。(A) BioLector XT (n = 2) 與 WAVE™ 25 (n = 1) 之 pH 值曲線時程比較。(B) 於 WAVE™ 25 進行之反應中，pH 值與 mRNA 之相關性。圖中顯示 pH 值與粗濃度之間的線性迴歸。補料條件採用恆定比例補料策略。
 

四、結論

1. 補料分批（Fed-Batch）策略能以更少的起始試劑產生更多的 mRNA，提升 IVT 的產量。相較於傳統分批製程（Batch），大幅提高酵素與 DNA 模板利用率，對製程經濟性具有重大影響。

2. Fed-Batch IVT 產出的 mRNA，其品質與 Batch 相當，確保製程的改變不影響產品效力。

3. 由於不同的補料策略會導致不同的產量與反應物利用效率，因此需要高通量的參數篩選，而 BioLector XT 具備低體積與高通量特性，能在極低試劑損耗下實現補料策略之高效優化。

4. 在 BioLector XT 上所開發的參數條件，被證實可線性放大至 GMP 等級的 ReadyToProcess WAVE™ 25。

5. 利用本研究所確定的補料分批策略，BioLector XT 每個反應孔產量可達 19 mg；而 WAVE™ 25 系統的生產規模則可產出 250 g 的 mRNA。

6. 研究發現 mRNA 粗濃度與 pH 值呈線性關係，意味著 pH 值可作為反應進度的即時監測指標。此發現開啟了「動態 pH 關聯補料配置」的可能性，能進一步優化反應表現與產量。


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