次世代定序（NGS）是什麼？原理、流程、應用與 Sanger 差異一次看懂

當研究進到「需要讀取 DNA 或 RNA 序列」這一步，很多人會先卡在幾個問題：定序到底在讀什麼？次世代定序（NGS）和傳統方法差在哪？自己的樣本與研究目的，適合用哪一種定序策略？這篇文章會依序整理定序與 NGS 的定義、技術原理、實際專案流程、常見應用類型，以及與 Sanger 定序的差異，最後說明委託服務前該準備哪些資訊。讀完後，你會比較清楚如何從研究問題反推適合的定序方法與分析規劃。

 

次世代定序是什麼？認識 NGS 的核心概念與用途

次世代定序（Next-Generation Sequencing，NGS）是一種能同時平行讀取大量 DNA 序列片段的高通量方法。 美國國家衛生研究院的National Cancer Institute(NCI) 的定義指出，NGS 可同時處理數百萬個核酸片段；實際 reads 數量與資料產出則會依平台、試劑規格與實驗設計而不同。這項平行處理的能力讓多基因、多樣本或大範圍研究成為可能。

而DNA 定序指的是確認 DNA 鹼基排列順序的過程；RNA 定序則通常會先將 RNA 轉換為可供定序的 cDNA，再取得轉錄體相關資訊。掌握序列資料後，研究者才能進一步比對差異、偵測變異或觀察基因表現。

NGS 常見於癌症與遺傳研究、微生物分析、轉錄體研究等情境。它的價值不只在於速度，更在於能同時處理更多基因、樣本與複雜問題。若涉及臨床檢測，相關結果仍須由合格專業人員結合檢體品質、檢測限制與個別臨床情況判讀，本文不提供個人化醫療建議。

NGS 原理是什麼？從核酸樣品到可分析資料的 4 個步驟

NGS 會將樣本中的核酸轉換為可供分析的序列資料。以下依資料生成順序說明四個核心環節，著重概念與資料流向，不涉及特定平台的化學反應細節。
 

1. 將核酸片段化或取得目標區域

DNA 或 RNA 會依研究方法被處理成適合讀取的材料；許多流程會將核酸片段化，Amplicon 策略則可能先擴增特定目標區域。這一步的關鍵在於樣本品質與目標設計，兩者都可能影響後續資料品質與可解讀性。
 

2. 製備定序文庫

文庫製備是把 genomic DNA 或由 RNA 轉換而來的 cDNA 製成可供定序的片段集合。依平台與方法不同，流程可能加入接頭（adapter）與樣本識別序列（index），讓多個樣本能在同一輪定序後被區分。不同平台的文庫製備細節並不完全相同，需依所選方法規劃。

3. 同時平行讀取大量序列片段

大量平行讀取是 NGS 的核心特徵，定序後會產生許多片段序列（reads）。整體資料量會受到樣本數、分析範圍、平台與定序深度影響，並非固定值。對許多主流短片段定序流程而言，研究者會將大量 reads 比對至參考序列，或透過組裝重建較長序列；其他長讀長方法則有不同的資料特性與分析策略。

4. 透過生物資訊工具整理與分析

原始 reads 通常不能直接回答研究問題，需先經過品質控管過濾低品質序列，再依方法處理比對或組裝，接著執行變異偵測、表現量定量、物種鑑定、功能分析或統計解讀。實際分析流程會隨研究問題與資料類型調整，不是所有 NGS 專案都套用相同分析流程。

 

NGS 與 Sanger 定序有什麼差異？

比較項目	NGS	Sanger 定序
適合問題	多基因、多樣本、轉錄體、外顯子或全基因體層級分析	單一或少量目標片段確認
資料產出	同時產生大量序列 reads	每次處理少量目標序列
規劃重點	樣本數、分析範圍、定序深度與生資流程	目標區域、引子設計與序列品質
主要限制	資料處理與解讀較複雜	通量較低，不適合大規模探索

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兩者並不是單純的新舊替代關係。NCBI 對定序技術的整理指出，Sanger 方法成熟，但通量有限；NGS 則以大量平行處理支援更大規模的研究。當研究需要多目標探索、比較多個樣本或掃描外顯子範圍時，NGS 通常較合適；若目標是確認單一或少量已知片段，Sanger 仍可作為直接的選項。在部分研究或檢測流程中，Sanger 也可能用於目標確認，但是否需要額外驗證，應依實驗目的、NGS 品質指標與實驗室驗證規範判斷。
 

NGS 專案如何規劃？從研究需求到結果解讀的 5 個步驟

我們在前一節說明序列資料如何產生；而這段則從實際委託或執行專案的角度，整理研究問題、樣本條件、方法選擇、定序與結果解讀如何串起來。每一步都有需要先確認的問題，越早釐清，越能減少樣本、方法與分析需求不一致所造成的徒勞無功。
 

Step 1：確認研究問題與樣本條件

先確認研究目的、物種、樣本來源、樣本數、實驗分組，以及要處理的是 DNA 還是 RNA。這些條件決定適合的定序策略與分析方向，也會影響後續的文庫設計、資料量與統計分析。

Step 2：核酸萃取與品質檢測

Illumina 的 NGS workflow將核酸萃取與品質確認列為前處理步驟。濃度、純度與完整性都可能影響文庫製備與最終資料品質；RNA 樣本還需特別留意保存與降解，因為降解可能使定量與表現分析產生偏差。

Step 3：選擇定序策略並製備文庫

依研究問題選擇 Amplicon、Metagenome、RNA-seq、WES 或 WGS 等策略，再規劃目標區域、樣本編碼與文庫條件。如果策略與研究問題不符合，即使定序本身順利，產出的資料也可能不足以回答原先問題。
 

Step 4：上機定序與資料品質控制

定序完成後，需確認 reads 數量、鹼基品質、接頭殘留或其他與該資料類型相關的品質指標。資料量不是唯一的品質判斷依據，還要回到實驗設計、涵蓋範圍與分析目的，確認資料是否足以支撐後續分析工作。

Step 5：生物資訊分析與結果解讀

定序資料需搭配品質控制、比對、定量、變異偵測、註釋或統計分析，才能形成可回答研究問題的結果。這個階段會決定原始資料能轉換成哪些研究資訊，因此分析方法、參考資料庫、參數與結果溝通都需要在專案中一併規劃。

 

Amplicon、Metagenome、RNA-seq、WES、WGS 怎麼選？

類型	主要觀察內容	適合問題	規劃提醒
Amplicon	特定基因或目標區域	目標變異、特定微生物區域或已知標的	需先確認目標區域、引子與深度需求
Metagenome	樣本內多種生物的遺傳資訊	微生物組成、功能潛力與環境樣本分析	需評估宿主背景、資料量與分析設計
Transcriptome / RNA-seq	RNA 表現與轉錄體變化	差異表現、轉錄本與剪接研究	RNA 品質、樣本數與實驗分組需先規劃
Whole-Exome / WES	蛋白質編碼相關外顯子區域	遺傳與疾病相關變異探索	不涵蓋大部分非編碼區域，捕獲範圍也會依方法而異
Whole-Genome / WGS	全基因體範圍	全基因體變異與物種基因體研究	資料量、成本與分析資源需求通常較高

選方法時，分析範圍較大不代表一定比較好。以人類基因體為例，NHGRI 說明外顯子區域約占全基因體 1.5%，WES 聚焦這個蛋白質編碼相關範圍，WGS 則涵蓋編碼與非編碼區域。若研究問題只落在特定區域，Amplicon 或 WES 可能較聚焦；想觀察基因表現差異可評估 RNA-seq，想了解環境樣本的微生物組成與功能潛力則可評估 Metagenome。先確定要回答什麼，再挑能回答它的方法，通常比先選最大範圍再想用途更有效率。
 

委託 NGS 服務前要準備什麼？需求與費用評估重點

如果研究團隊正在評估委託圖爾思生技 NGS 技術服務，提早整理需求會讓服務團隊更快判斷適合的定序類型、樣本規格與分析方向。
建議可以先準備：

• 研究目的：想回答什麼問題、預期得到哪一類證據
• 樣本類型與數量：物種、組織、體液、環境樣本與樣本數
• DNA/RNA 類型與品質：是否已萃取、濃度與完整性概況
• 實驗分組：是否有對照組、處理組或多時間點設計
• 預期分析結果：變異列表、表現量比較、物種組成、功能註釋等
• 後續需求：是否需要驗證、客製化圖表或報告討論

事先把上述資訊整理好，討論時就能聚焦在定序策略與分析設計，減少前期反覆確認。
 

次世代定序常見問題 FAQ

Q1：定序是什麼意思？

定序是確認 DNA 鹼基排列順序的過程；RNA 研究則通常會透過相應的文庫流程取得轉錄體序列資訊。不過取得序列只是起點，原始資料仍需依研究目的進行品質控制、比對、變異偵測或表現量分析，才會轉換成可解讀、能回答問題的結果。
 

Q2：次世代基因定序有需要做嗎？

不是所有研究或檢測都需要 NGS。是否採用，應依問題範圍、樣本條件與預期結果評估；若只是確認單一片段，較低通量的方法可能已足夠。若涉及臨床檢測或治療決策，還需由合格專業人員依檢測適應情境、方法限制與個別情況判斷，不宜只憑技術名稱決定。
 

Q3：WES 和 WGS 有什麼差別？

WES（全外顯子定序）聚焦蛋白質編碼相關的外顯子範圍；WGS（全基因體定序）則涵蓋編碼與非編碼區域。兩者在可分析範圍、資料量、成本與限制上不同：WGS 能提供更廣的區域資訊，但通常需要更多資料處理資源；WES 較聚焦，卻可能漏掉未納入捕獲範圍或非編碼區域的變異。選擇時應回到研究問題所需的範圍。
 

Q4：次世代定序費用怎麼評估？

費用會受到樣本數與品質、定序類型、分析範圍、深度、資料量，以及後續生物資訊需求影響，不同報價也可能包含不同的 QC、分析與解讀項目。較實際的做法是先備妥研究目的、樣本條件與預期分析結果，再確認報價所涵蓋的工作範圍。
 

Q5：次世代定序和基因檢測是一樣的嗎？

兩者不完全相同。NGS 是取得大量序列資料的一類技術方法，基因檢測則是可能的應用目的之一。基因檢測也可能採用 PCR、Sanger 定序或其他方法完成；NGS 也廣泛用於癌症研究、微生物分析與轉錄體研究等非臨床情境。評估時應分清楚「想回答的問題」與「用來取得資料的方法」。
 

先釐清研究問題，再選擇合適的 NGS 類型

NGS 的價值，在於把大量序列資訊轉成可回答研究問題的證據，但前提是研究目的、樣本條件、定序類型與生資分析必須一起規劃。如果正在評估NGS分析，建議可以先把研究目的、樣本狀況與想得到的分析結果整理成清單，與圖爾思技術服務團隊討論可行流程。

引用連結、參考連結

• NHGRI：DNA Sequencing Fact Sheet：定序定義與 DNA 序列基本概念。
• NCI：Next-generation sequencing：NGS 定義、平行處理與常見類型。
• Illumina：NGS Workflow Steps：核酸萃取、文庫製備、定序與資料分析流程。
• NCBI Bookshelf：Applications of Clinical Microbial Next-Generation Sequencing：Sanger 與 NGS 的通量及技術背景。
• NCBI Bookshelf：Biological Sequence Analysis：NGS 生物資訊分析流程。
• NHGRI：Exome：人類外顯子組範圍與 WES 概念。
• NHGRI：The Cost of Sequencing a Human Genome：定序成本範圍與估算因素。
• ​圖爾思生物科技：Next-Generation Sequencing：服務類型與生物資訊分析支援。