蛋白質定量分析

無標記定量分析流程

• 樣品前處理： 萃取各組樣本的蛋白質，並使用胰蛋白酶(Trypsin)將其水解為胜肽。

• 質譜分析(LC-MS/MS)： 樣本依序單獨進入高效液相層析系統進行分離，並透過高解析度質譜儀進行一級與二級質譜掃描。

• 數據對齊與定量： 運用軟體將不同批次的液相層析保留時間進行對齊，並透過比對層析峰面積或譜圖計數來計算蛋白質的相對豐度。

標記定量分析流程

經過酵素處理的樣本，在化學反應中將 iTRAQ 試劑的特異性反應基團（amine specific peptide reactive group）與胜肽段的氨基末端進行共價連接（如下圖）。

不同樣本的胜肽段分別被iTRAQ113-121 (以8個樣本為例) 的標籤標記。 將標記好的8組胜肽段混合後，進行LC-MS/MS分析。由於8組樣品中相同蛋白質的同一條胜肽段被8種iTRAQ試劑分別標記後，其質量(M)仍然是一樣的 (8種同位素標籤搭配不同平衡團後其總質量為相同) 。因此，在一級質譜（MS1）上，它們的質荷比（m/z，質量/電荷比）值相同。經過碎裂反應後產生的碎片離子（fragment ions），可透過資料庫的搜尋推斷出胜肽段所屬的蛋白質。而胜肽段上釋放出來的8個報告基團標籤—113、114、115、116、117、118、119、121的強度即代表了8組樣品同一胜肽段的豐度（abundance）。


送樣須知、實驗需求單以及Protein extraction protocol請參閱樣品處理網頁附件。