全長16S擴增子定序 (Full-Length 16S Amplicon Sequencing)
16S rRNA為原核生物核糖體小次單元的重要組成，序列包含數個保守和高變區域，其中具有屬或種特異性的高變區域，被認為是最適用於細菌系統發育和分類鑑定的指標。結合PacBio三代定序平台的讀長優勢，定序全長16S序列，能取得種 (Species)甚至到菌株 (Strain)層級的物種註釋資訊，大幅提升資料分析的解析度，因此逐漸成為微生物體領域中研究環境微生物多樣性及群落組成差異的重要策略之一。
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分析流程
定序下機的原始數據會搭配 PacBio 標準軟體校正 Circular consensus sequence (CCS) 並產生 CSS reads，並定義Q值達Q20的CCS reads為HiFi reads，為了提供更高品質的數據，圖爾思提供準確率達99.9％的高規格 Q30 HiFi reads。
校正後的 CCS 序列作為分析的開端，接著去除引物（Primer）與執行 DADA2 去噪分析。去噪分析後獲得 ASVs（Amplicon Sequence Variants），再接續物種分類分析，包括物種豐度、Alpha 多樣性計算、樣本物種多樣性評估、Venn 圖等分析，以得到樣品內物種豐富度和均勻度資訊、不同樣品或分組間的共有和特有 ASVs 資訊等結果。
校正後的 CCS 序列作為分析的開端，接著去除引物（Primer）與執行 DADA2 去噪分析。去噪分析後獲得 ASVs（Amplicon Sequence Variants），再接續物種分類分析，包括物種豐度、Alpha 多樣性計算、樣本物種多樣性評估、Venn 圖等分析，以得到樣品內物種豐富度和均勻度資訊、不同樣品或分組間的共有和特有 ASVs 資訊等結果。
服務流程
項目週期：樣品通過檢測後，約40個工作天(含分析)。
樣品需求
1. DNA總量:
1. PacBio平台定序: ≧ 500 ng
2. DNA 濃度: ≧ 30 ng/ ul (Qubit®測定)
樣品體積: ≧ 20 ul
※濃度及體積為個別的建議最低要求，總量仍需達到 500 ng
2. 樣品純度及片段大小：
OD260/OD280 = 1.8-2.0
DNA 無降解且無汙染
建議先行以電泳膠圖確認片段大小及DNA完整度，並於送件時提供膠圖結果
1. PacBio平台定序: ≧ 500 ng
2. DNA 濃度: ≧ 30 ng/ ul (Qubit®測定)
樣品體積: ≧ 20 ul
※濃度及體積為個別的建議最低要求，總量仍需達到 500 ng
2. 樣品純度及片段大小：
OD260/OD280 = 1.8-2.0
DNA 無降解且無汙染
建議先行以電泳膠圖確認片段大小及DNA完整度，並於送件時提供膠圖結果
定序規格
三代長片段定序：PacBio Sequel IIe
Courtesy of PacBioof California, Inc.
Courtesy of PacBioof California, Inc.
送樣建議
樣品建議：
糞便
1. 保存液1 mL (建議3-5 mL)，檢體與保存液均質，常溫或凍存運送
2. 新鮮檢體1 g (建議3-5 g)，-80度保存及運送
唾液
1. 新鮮檢體1 mL (建議3-5 mL)，-80度保存及運送
組織 (口腔/皮膚/生殖道)
1. 棉棒採樣端置放於保存液中，常溫運送
2. 棉棒採樣端直接置放於1.5 mL微量離心管中，-80度保存及運送
環境樣品
1. 土壤/底泥/沉積物1 g (建議3-5 g)，-80度保存及運送
其他注意事項
1. 若為腸道內容物採樣，需將腸道分離，內容物取出冷凍保存
2. 採樣棉棒建議以無菌剪刀將採樣端剪下後保存
3. 環境樣品建議在採樣後先進行混勻後分裝於1.5 mL微量離心管
FL16S雲平台-線上分析工具
- 雲平台功能介紹：
▶ 把圖變成你喜歡的顏色與形狀
直接在平台上調整製圖顏色、形狀及大小
▶ 任你自由調整的篩選門檻與參數
線上調整分組及樣品名稱
調整p-value、Fold Change等等篩選門檻
▶ 一種分析，多種呈現方式
任意選擇適合你的呈現方式 (長條圖、物種階層熱樹圖、文氏圖等)
同步附上圖片解說
▶ 讓圖動起來，互動介面超方便
各組物種交集圖，游標滑到目標位置就可以看到交集的物種數量
▶ 關聯分析自己動手做
任意上傳各類因子的數值與微生物做關聯分析
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