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29 2022.12

解"泌"健康:液態活檢的外泌體迎向臨床診斷新趨勢

外泌體 (Exosome) 最初被發現於綿羊的網狀細胞,由其所釋放;大量的研究工作隨後衍生,研究發現Exosome幾乎存在於所有體液中:血液、尿液、腦脊液、唾液、胸腔積液、腹水、羊水、母乳和支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid)。外泌體起源於細胞內膜,通過多泡體而形成;如此特殊的生成途徑使外泌體包含了母細胞為特徵的各種分子,包括核酸(DNA、mRNA、microRNA(miRNA)、lncRNA、circRNA等)、蛋白質和脂質,而這些分子也在外泌體,其脂質雙層封閉結構的保護下,通過循環系統進行遠距離運輸至其他組織、甚至器官。

 

想當然,外泌體是液態活檢的重要組成物之一,且外泌體在最廣泛使用的液態活檢:
血液中的占比遠高於腫瘤衍生血小板 (tumor‐educated platelets, TEPs)、循環腫瘤細胞(circulating tumor cells, CTCs)和循環腫瘤DNA(circulating tumor DNA, ctDNA),且保存容易、穩定。在過去的10年裡,尤其是在2018年,外泌體作為診斷的生物標誌物載體引起了外顯子研究的最大興趣。

截至2020年1月的PubMed搜索,過去5年中有關外泌體診斷功效的出版物,以MeSh關鍵字搜尋 "外泌體 "或 "小細胞外囊泡"、"診斷 "或 "生物標誌物 "和 "液體活檢",有88篇關於DNA的相關出版物,695篇關於RNA(包括74篇關於mRNA,534篇關於microRNA,52篇關於lncRNA,14篇關於cyclRNA),以及824篇關於蛋白質。蛋白質是外泌體被研究最多的內容,其次是miRNA
 

在使用或探索外泌體作為診斷生物標誌物時,外泌體的純化和分離過程至關重要。超高速離心法曾經是黃金標竿、研究外泌體的入門心法,但純化方法日益月新,實驗者可根據自己的實驗目的、時間性、工作習慣選擇分離方案:以粒徑與聚合物來純化外泌體、並同時有效去除蛋白質、鹽類等污染的size exclusion chromatography (SEC)與tangential flow filtration (TTF);最簡單、高通量和快速的聚合物沉澱 (polymer precipitation);能夠得到最純外泌體樣本的免疫親合法 (immunoaffinity)。

面對外泌體在未來的發展性,圖爾思通通準備好了:


一、提供高純度沉澱法的外泌體分離試劑交給 - 自有品牌TOOLS

一出手就要方便、好用,提供高純度的沉澱法的外泌體分離試劑,並根據樣品的複雜性調整配方

>> TOOLS Exosome Isolation

 

二、推出免疫親合法,為精準療法而生的 - CROYEZ

免疫親合法套組 >> Exo-Max Exosome Purification Kit

 

三、提供效率極佳的TTF與SEC管材料 - HansaBioMed (Lonza)

致力於外泌體研究的 HansaBioMed (Lonza) 也正式由圖爾思代理,提供效率極佳的TTF與SEC管等材料;多種體積可選擇,且可重複使用 5- 20 次,有效分離、濃縮、純化外泌體
定義與檢視分離所得外泌體樣本的品質是下一個必經的過程,也是另一項挑戰,根據《Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018》(MISEV2018),使用多種技術檢視外泌體的純度、型態來評估分離方法和建立生物標誌物是至關重要。利用布朗運動測量粒徑大小的nanoparticle tracking analysis (NTA),長期被認為是測量外泌體粒徑的黃金標竿法,同時可測量顆粒濃度。

 

四、圖爾思技術服務中心使用備受業界、學術界推崇的Malvern Panalytical NanoSight3000提供NTA服務。

NanoSight NTA系統支持ISO19430:2016顆粒追踪分析(PTA)方法和ASTM E2834-12(2012)通過NTA測量懸浮液中納米材料的顆粒大小分佈的標準指南。
>> NTA粒徑&濃度檢測 
 
圖爾思技術服務中心提供前瞻技術 Nano Flow cytometry 分析服務,此服務可同時揭示了外泌體的多重參數,除外泌體的大小、濃度,亦結合螢光系統,搭配免疫螢光染色以分析外泌體的表面蛋白,提供外泌體的化學屬性和生物特徵;有效分析範圍是7-1000 nm的生物膜顆粒,因此應用性不僅止於外泌體,亦可用於定義lipidnanoparticle (LNP)與包裹率、以及分析病毒顆粒。我們的服務採用NanoFCM FLOW NANOANALYZER,此系統已被多個知名的國家級研發單位與醫藥業龍頭所採用,如:美國國家衛生局 (National institutes of Health)、Lonza、MD Anderson Cancer center、evotec等,讓研究與國際接軌,歡迎聯繫我們
 
另形態特徵則可用掃描電子顯微鏡(SEM)和透射電子顯微鏡(TEM)。
而質譜分析 (Mass spectrometry, MS) 和miRNA檢測則被進一步用於深入揭示外泌體的生物特徵和疾病信息。
二維凝膠電泳(two-dimensional gel electrophoresis)和液相色譜串聯質譜(liquid chromatography coupled tandem mass spectroscopy, LC-MS)時常被應用於分析外泌體的蛋白組成。

圖爾思技術服務中心提供質譜分析技術的蛋白質體學服務 ;我們的技術部門在操作質譜儀和處理各種類型的樣品方面有超過10年的經驗,並且在處理外泌體方面有豐富的經驗。
除了從外顯子中提取和鑑定總蛋白外,我們的服務團隊還提供exsome shaving的特別蛋白質萃取流程,只提取並特別分析外泌體的表面蛋白;後續可進行定性 (了解蛋白組成)與定量分析,以及豐富多元的生物資訊服務
想了解更多關於我們的MS蛋白質組學服務 >> Proteomics Service
 
另外泌體表面蛋白的分析技術,圖爾思2022年底率先與誕生於Proximity Ligation assay (PLA)技術發源地:瑞典的Uppsala University,將此技術發展到偵測外泌表面蛋白的Vesicode合作。
 
Vesicode獨家發展的Proximity binding assay技術,利用特別設計的Antibody code與rolling circle amplication (RCA) barcoding,兩組編碼組成能夠辨識單一外泌體之表面蛋白的辨識碼;這樣獨特設計能夠單次、每個樣本有效分析10^5-10^6外泌體,且是每一個獨立的外泌體的表面蛋白組成,且無論是純化的外泌體樣本,還是珍貴液態檢體都可以直接進行委託服務,液態檢體,如:血漿、尿液、組織液僅需要5 uL服務。

外泌體的miRNA 被證實在多種疾病中是可作為在早期臨床診斷有用的生物標誌物,如:癌症、感染 (來自免疫細胞的外泌體)、代謝異常、神經退行性疾病等,且外泌體中的miRNA的含量穩定而豐富,是診斷指標的開發重點。

對於想要找出與疾病顯著相關的miRNA目標的研究階段,TOOLS miRNA RT-qPCR analysis system能提供了準確和令人滿意的結果。
TOOLS miRNA RT-qPCR analysis system的核心是獨家開發設計的、僅針對成熟miRNAs的環型RT引物 (primer),搭配序列兼容的qPCR引物和TaqMan定量螢光探針,對目標成熟miRNA的高度特異性識別。
目前已有預先設計和驗證的 primer/probe sets,針對人類mature miRNA有超過200個,小鼠100個,大鼠80個;另可以客製設計,亦經過每批驗證才會出貨,隨貨檢附Certificate of authenticity,為成功的實驗打下基礎。
TOOLS miRNA RT-qPCR analysis system易於使用,採用廣為人知、簡單的2 step RT-qPCR 操作程序,就可快速、敏感和特異地分析 mature miRN的表達量。
探索如何使用TOOLS miRNA RT-qPCR檢測系統 >>miRNA Assay Set
 

Reference

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  • Huda MN, Nafiujjaman M, Deaguero IG, Okonkwo J, Hill ML, Kim T, Nurunnabi M. Potential Use of Exosomes as Diagnostic Biomarkers and in Targeted Drug Delivery: Progress in Clinical and Preclinical Applications. ACS Biomater Sci Eng. 2021 Jun 14;7(6):2106-2149.
  • Li S, Yi M, Dong B, Tan X, Luo S, Wu K. The role of exosomes in liquid biopsy for cancer diagnosis and prognosis prediction. Int J Cancer. 2021 Jun 1;148(11):2640-2651.
  • Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 2018 Nov 23;7(1):1535750.
  • Wu, D., Yan, J., Shen, X. et al. Profiling surface proteins on individual exosomes using a proximity barcoding assay. Nat Commun 10, 3854 (2019).
  • Mirzaei, R., Babakhani, S., Ajorloo, P. et al. The emerging role of exosomal miRNAs as a diagnostic and therapeutic biomarker in Mycobacterium tuberculosis infection. Mol Med 27, 34 (2021).
  • Yao ZY, Chen WB, Shao SS, Ma SZ, Yang CB, Li MZ, Zhao JJ, Gao L. Role of exosome-associated microRNA in diagnostic and therapeutic applications to metabolic disorders. J Zhejiang Univ Sci B. 2018 Mar.;19(3):183-198.
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