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2021．12
【RNAseq 3小學堂】RNAseq 序列品質控管
原創文章 引用請註明出處
#RNAseq #QC #3小學堂
|| 3分鐘速解RNAseq分析，本周介紹RNAseq序列品質控管 ||
相信大家都聽過 Garbage in, garbage out 這句話，要有好的分析報告首要就是要有好的數據，那在 RNAseq 分析之前會做那些分析確認序列品質，就讓小編來一一介紹囉~！
|| 不要盡信 Fastqc 結果！要考慮 library 類型！ ||
NGS 數據下機之後，首要當然是進行 fastqc 來檢查序列數量、長度與品質，可是好奇怪，為什麼我的 RNAseq 數據有好多項目都顯示警告，是我得到的數據不好嗎？
因為 Fastqc 軟體對序列的評斷標準是以 Whole genome shotgun DNA library 的規格下去訂定的，所以在檢視序列品質的同時，這樣的標準經常會讓 RNAseq library 跳出警告，而這些警告的成因常常是樣品本身的特性，而不是定序方面的問題。
影響Fastqc軟體評斷的因素：
1. Transcript表現量差異：在樣品中 transcript 的表現並不相同，表現較多的 transcript 自然會被定序較多次，但在進行 fastqc 時有可能會被辨識為異常的 duplication 或 overrepresent sequence，也會連帶影響到 GC content ，使其偏離理論值。
2. Libarary kit特性：由於 RNAseq Library kit 建庫的特性，per base content 在前 10-12 bp 會有比較不平均的現象，這是正常現象。
|| 去除過濾清乾淨！Trimming ||
確認序列品質後會先進行序列品質過濾，去除品質較低的序列並移出人為添加的 adapter，得到高品質定序序列。
序列篩選結果會以堆疊長條圖展示，長條圖長度代表各項比例，紫色代表定序雙端皆保留的數量、綠色代表僅 Read1 通過篩選條件的比例、紅色代表僅 Read2 通過篩選的比例、棕色則代表雙端都移除的數量。
|| 你的物種不是你的物種 ?||
由於 RNAseq 分析仰賴參考序列的資訊，在正式進行分析之前會對序列進行抽樣，比對 NCBI 資料庫，判斷是否有外來物種的基因，出現其他物種的可能原因有非常多種，包含實驗設計(將人類細胞打入老鼠、餵養細胞等等)、細菌或病毒感染樣品後的基因表現等等。
當然了，如果你選擇的分析流程是不需要參考序列的 denovo 組裝就不需要進行物種檢查和序列映射，不過在這裡我們不討論 denovo 分析流程。
|| 序列映射(mapping) 是 RNAseq 分析的基礎！ ||
品質管控後的序列將進行參考基因體的映射統計，作為參考，映射到參考基因體的序列總數，通常 Total Mapped 大於 80%。
將定序序列映射至參考基因體後，可利用映射區域的性質與覆蓋率來檢查分析的結果。由於 RNA-Seq 的定序目標為參考基因體的外顯子（exon），因此可經由統計映射區段在參考基因體的區域性質，檢查序列是否大部分都落在外顯子上 (見下圖)。
將所有基因的長度標準化後，統計映射序列的深度與覆蓋率，可以觀察曲線是否有不正常的突然增減，判斷映射結果的品質。
理想的基因覆蓋率是均勻分布的，而基因的頭尾區段映射的覆蓋率會較低，因此呈現一個平坦的高原，曲線與 RNA 品質和建庫方法有關，以 poly A 建庫的 RNAseq library 為例， RNA 品質不佳則容易出現曲線往 5' 方向滑坡的現象，如下圖。
基因表現量是藉由定序的序列片段映射（Mapping）到參考基因體上的基因區段或是外顯子計算出來的Raw count，而Raw count 如何轉換為可用於分析的數值，請參考上一篇。
檢查數據之後就可以進行分析了，但如果你進行的是有重複的實驗，還有一項相關性分析先觀察實驗的穩定性和可靠程度，下一回，帶給你樣品間相關性分析~!
圖爾思生物科技/微生物體研究中心
顏維萱/沈筱凌
顏維萱/沈筱凌
