Spatial transcriptomics(空間轉錄體學)是什麼？從空間基因表現到實驗與分析規劃

研究腫瘤、神經或發育組織時，常遇到同一個問題：RNA-seq 找到了差異基因，單細胞資料也分出了細胞類型，卻看不出這些細胞在組織裡的位置、彼此距離多遠，也無法判斷它們是否位在病灶邊緣。

而Spatial transcriptomics 能在保留組織結構的條件下讀取基因表現，但技術路線很多，解析度、可測基因數、樣本相容性和分析難度都不同。研究團隊可從它與傳統轉錄體分析的差異、資料產生流程、技術原理、實驗設計條件與分析問題，判斷較合適的方法。

Spatial transcriptomics 如何補足傳統轉錄體分析

Spatial transcriptomics（空間轉錄體學）是在保留組織空間結構的情況下，量測組織中各個位置基因表現的一類技術。每一筆表現資料都帶有對應的空間座標，研究者可以把基因表現疊回組織影像，觀察某個基因或細胞族群在組織中的分布，以及不同區域之間的轉錄差異；此概念可追溯至以組織切片與空間條碼建立表現圖譜的原始研究。

它和 bulk RNA-seq、single-cell RNA-seq（scRNA-seq）回答的問題不同，差異主要在解析單位與是否保留空間分佈位置：

比較項目	Bulk RNA-seq	Single-cell RNA-seq	Spatial transcriptomics
量測單位	整份樣本的混合 RNA	單一細胞或細胞核	組織上的空間點、網格或單一細胞
是否保留位置	否	否，需先解離組織	是，每筆資料有空間座標
擅長回答的問題	組別間整體表現差異、訊號途徑變化	細胞類型組成、稀有細胞、細胞狀態	細胞在哪裡、區域結構、鄰近細胞關係
主要限制	細胞組成差異會稀釋或混淆訊號	解離可能造成細胞比例偏差與壓力反應	依技術而有解析度、靈敏度或基因數限制
常見用途	藥物處理前後比較、生物標記初篩	建立細胞圖譜、找新亞群	腫瘤邊界、組織分區

bulk RNA-seq 的成本與分析門檻低，適合比較組別差異，但它看到的是平均值。某個基因上升，可能是每個細胞都上調，也可能只是某群細胞的比例變多。scRNA-seq 能分辨細胞類型與狀態，但組織解離後，細胞原本的鄰居和所在區域都無法保留。

空間轉錄體學補上的是位置這個維度。例如在腫瘤研究中，研究者可以直接比較腫瘤核心、浸潤邊緣與周邊基質的表現差異，或觀察免疫細胞是聚集在腫瘤外圍還是已經進入腫瘤內部。這類問題跟組織結構有關，單靠 bulk 或 single-cell 資料很難直接回答。

Spatial transcriptomics 資料怎麼產生？

不同平台的化學原理差異很大，但從組織到空間表現圖譜，大致會經過五個階段，每個階段都可能影響最後的資料品質。

• 樣本與切片準備：組織依平台需求製成新鮮冷凍（fresh frozen）、固定冷凍或福馬林固定石蠟包埋（FFPE）樣本，再切成數微米厚的切片置於玻片或捕獲晶片上。影響結果的因素包括離體到固定或冷凍的時間、固定時間長短、RNA 降解程度、切片厚度，以及切片是否皺褶、破裂或貼附不平。RNA 品質常以 RIN 或 DV200 等指標評估，FFPE 樣本多參考 DV200；實際接受標準與切片條件應依平台組織準備手冊及組織類型確認。
• 組織影像或染色：多數流程會做 H&E 染色或免疫螢光染色並取得高解析影像，用來辨識組織形態、定位分析區域，後續也會用於影像對齊與細胞分割。影像對焦、染色均勻度和掃描解析度，會直接影響空間座標對位與細胞邊界判定的準確度。
• RNA 捕獲或原位偵測：定序型技術會讓組織 RNA 或探針被帶有空間條碼（spatial barcode）的寡核苷酸捕獲；成像型技術則讓探針直接在組織內與目標 RNA 雜交。這一步驟主要受透化（permeabilization）條件、探針設計、組織類型與 RNA 完整度影響。透化不足會降低捕獲量，過度則可能讓 RNA 向外擴散，使位置訊號變得模糊。
• 定序或影像讀取：定序型方法建庫後以次世代定序讀取序列與空間條碼；成像型方法透過多輪雜交、螢光成像與解碼辨識每一個 RNA 分子。定序深度、文庫複雜度、影像訊號雜訊比、光學擁擠（optical crowding）與自體螢光，都會影響偵測靈敏度。
• 空間座標與表達矩陣建立：軟體把條碼或螢光訊號轉成空間座標，並與組織影像對位，產生「位置 × 基因」的表現矩陣。成像型或高解析資料通常還要做細胞分割，把 RNA 分子歸到各個細胞。這一步的影像對位誤差與分割演算法，會影響每個細胞或每個點的表現量。

實務上，樣本前處理最容易被低估。只要組織 RNA 品質不佳或切片位置選錯，後面的定序量或分析方法都很難補救，因此正式上機前通常會先做 RNA 品質檢測與預實驗切片，確認組織型態與目標區域是否合適。

Spatial transcriptomics 兩大技術怎麼選？

空間轉錄體學技術大致分成定序型（sequencing-based）與成像型（imaging-based）兩類。定序型方法以空間條碼標記位置，再用定序讀取整個轉錄體或大範圍基因；成像型方法以探針在組織上直接偵測目標 RNA，定位精度可達次細胞層級。

比較項目	定序型技術	成像型技術
類別示例	Visium/Visium HD、Stereo-seq、Slide-seq 等	MERFISH/MERSCOPE、Xenium、CosMx、seqFISH 等
訊號讀取方式	空間條碼捕獲 RNA 或探針後建庫，以 NGS 定序	多輪探針雜交與螢光成像，解碼每個 RNA 分子位置
空間解析度	依平台差異大：早期點陣型每點直徑約 55 µm，可能包含多個細胞；Visium HD 的原始條碼方格為 2 × 2 µm，官方分析可輸出 8 與 16 µm 等分箱；Stereo-seq 使用 0.22 µm DNA nanoball 陣列。可用解析度仍取決於組織、分箱與分析設定	單一分子定位，可達次細胞解析度，能呈現 RNA 在細胞內的分布
可測基因範圍	多為全轉錄體或大範圍探針組，適合探索型研究	以預設或客製 panel 為主；例如 Xenium Prime 5K 為 5,006 基因並可加選基因
組織覆蓋	捕獲區域從數毫米見方到公分級晶片，依平台而定	可掃描較大面積，但成像時間與成本隨面積與基因數增加
樣本相容性	新鮮冷凍、固定冷凍、FFPE 等依平台與試劑版本而定；以 Visium HD 為例，現行手冊列有這三類切片流程	依平台、panel 與試劑而定；Xenium Prime 5K 明列支援 FFPE 與新鮮冷凍樣本
資料量	定序資料大，高解析平台的座標點數量龐大	原始影像檔極大，轉錄本座標與細胞分割結果也需大量儲存
常見限制	較低解析度平台需去卷積推估細胞組成；高解析平台每單位讀數稀疏	只能測 panel 內基因，難發現 panel 外的新標的；細胞分割誤差會影響結果

選擇方向可以簡單整理成兩種情境。研究處於探索階段，還不確定關鍵基因是哪些，定序型技術的全轉錄體覆蓋較有優勢；如果已有明確的目標基因群或細胞標記，想看精確的細胞位置與細胞間距離，成像型技術通常更合適。不少研究會兩者並用，先用定序型資料找出關鍵區域與候選基因，再以成像型平台驗證細胞層級分布。

平台規格更新很快，同一品牌的不同世代產品在解析度、捕獲面積與支援樣本型態上差異明顯，因此規劃時應以最新版試劑與晶片規格為準。

實驗設計先釐清的五個問題

在比較平台之前，先把以下五個條件想清楚，選型會單純很多：

• 研究目的：屬於探索未知機制，還是驗證特定假說？探索型研究需要較廣的基因覆蓋；驗證型研究重視目標基因的靈敏度與定位精度。也要確認要比較的是組別差異、區域差異還是細胞間互動，這會影響樣本數與統計設計。
• 樣本型態與保存：樣本是新鮮冷凍、FFPE 還是臨床存檔組織？保存時間多久、RNA 品質如何？回溯型研究常只能使用 FFPE 蠟塊，平台必須支援該樣本型態，DV200 等品質指標也要事先評估。物種同樣重要，成像型平台的 panel 可能只支援人類或小鼠。
• 所需解析度與組織範圍：要看的結構有多大？分析腫瘤區塊或腦區分層時，中等解析度可能就足夠；分析免疫突觸或細胞緊密接觸時，則需要單細胞或次細胞解析度。組織面積也要與捕獲區域相符，大型組織可能需要分區或選擇大面積晶片。
• 是否整合單細胞或病理影像：低解析度資料通常需要搭配同類組織的 scRNA-seq 參考資料做細胞類型推估。若研究要結合病理判讀，例如腫瘤分級、病灶標註或多重免疫螢光，就要確認平台能否在同一切片或相鄰切片取得對應影像。
• 預算與分析資源：費用除了試劑與晶片，還包括定序量、上機時間、資料儲存與生物資訊分析人力。高解析或大面積資料可能達數百 GB 以上，需要足夠的運算資源與熟悉空間分析工具的人員，預算不足時可先以小規模試驗評估資料品質再擴大。

 

Spatial transcriptomics 資料分析要注意那些要點？

空間資料分析沿用了部分單細胞分析流程，但多了空間座標這個維度，分析任務可依序整理如下：

分析任務	要回答的問題	規劃提醒
品質控制	哪些點或細胞的偵測數過低、組織外是否有背景訊號、切片是否有破損區	過濾門檻要依組織特性調整，壞死區或脂肪區本來就訊號偏低，不宜一律剔除
正規化	如何校正不同位置的捕獲效率與讀數差異	空間點的總讀數可能反映細胞密度，正規化方式會影響區域比較結果
空間域辨識	組織可分成哪些具相似表現特徵的區域	結合表現量與空間鄰近關係的分群方法，通常比單純表現分群更貼近組織結構
細胞類型映射	每個位置有哪些細胞、比例多少	點陣型資料需以 scRNA-seq 參考資料去卷積；參考資料的組織來源、物種與細胞類型完整度會直接影響結果
空間差異基因	哪些基因呈現明確的空間分布模式或區域差異	需區分真實空間模式與切片邊緣效應、技術批次效應
細胞互動推論	哪些細胞彼此靠近，可能透過哪些配體與受體溝通	推論結果屬於假說，需以功能實驗或蛋白層級資料驗證
視覺化	如何把基因、細胞類型與區域疊合在組織影像上呈現	圖像比例、色階與對位精度會影響讀者對空間分布的判讀

有兩個因素特別容易影響詮釋。第一是演算法選擇：空間域辨識、去卷積和細胞互動分析都有多種工具，不同工具對同一份資料可能給出不同的分區或細胞比例，建議至少以兩種方法交叉比對，並對照組織病理形態確認結果是否合理。第二是單細胞參考資料：參考資料中沒有的細胞類型，去卷積時就無法被辨識，參考資料與空間樣本的處理條件差異過大時，也會造成細胞比例偏差。

另外，空間資料中相鄰位置本身就有相關性，一般的獨立樣本統計假設不一定成立。進行組別比較時，應以生物重複（不同個體或樣本）作為統計單位，避免把同一切片上的大量點當成獨立樣本而誇大顯著性；已有針對多樣本與細胞組成差異的空間差異表現統計模型可供評估。

 

常見問題

Spatial transcriptomics 和 single-cell RNA-seq 有什麼不同

single-cell RNA-seq 擅長描述細胞層級的轉錄特徵，能細分細胞類型、狀態與稀有族群，但組織需要先解離，細胞的位置資訊會因此消失。Spatial transcriptomics 保留每筆表現資料在組織中的座標，可以回答細胞在哪裡、和誰相鄰、屬於哪個組織區域。兩者常搭配使用：scRNA-seq 提供細胞類型參考，空間資料再把這些細胞類型對應回組織位置，形成更完整的組織圖譜；在點陣型資料中，這類參考資料也可用於細胞組成推估。

Spatial transcriptomics 是二維還是三維分析

常見的空間轉錄體資料來自單一組織切片，產生的是二維座標。研究如果需要立體結構資訊，可以取連續切片分別分析，再透過影像對位與演算法重建三維表現圖譜；部分方法可在較厚的組織中做原位偵測，取得有限的深度資訊。三維重建會增加切片數量、成本與對位難度，也要處理切片間變形與遺失的問題，實際能做到的程度需依選用的方法與實驗設計而定。

哪些研究問題適合使用 Spatial transcriptomics

研究假說和組織位置有關時，空間轉錄體學最能發揮作用。常見情境包括：

• 腫瘤微環境：比較腫瘤核心、浸潤邊緣與基質區的表現差異，分析免疫細胞浸潤程度與空間分布，或觀察腫瘤內異質性。
• 神經科學：描繪腦區與皮質分層的基因表現，分析神經退化疾病中病灶周邊細胞的變化。
• 發育生物學：追蹤胚胎或器官發育過程中，基因表現如何隨位置與時間形成梯度與分區。
• 免疫與發炎研究：分析淋巴結、腸道或皮膚中免疫細胞的聚集結構與局部發炎反應。
• 組織病理：把病理切片上的形態特徵與分子表現對應起來，輔助研究纖維化、病灶邊界或組織重塑的機制。

選擇前仍要回到研究假說與樣本條件：問題若與位置無關，bulk 或 single-cell 資料可能就已足夠；樣本 RNA 品質不佳、組織量太少時，也需要先評估是否能產生可用資料。

空間轉錄體實驗從樣本前處理、平台選擇到資料分析環環相扣，任一環節的條件都會影響最後的結論。圖爾思生物科技提供生命科學研究相關產品與技術服務，可協助學研與產業團隊依研究需求評估合適的實驗與分析方向。整理好這些條件後，就可以和圖爾思生技的技術服務團隊討論具體的研究規劃。


引用連結、參考連結

• Spatial transcriptomics 原始研究（Science, 2016）：驗證以組織切片及空間條碼建立表現圖譜的技術基礎。
• Visium HD Spatial Gene Expression Performance（10x Genomics）：驗證 2 × 2 µm 條碼方格與 8 µm 分箱的規格。
• Visium HD 試劑操作手冊（10x Genomics）：驗證 Visium HD 支援的切片類型與規格應以現行手冊為準。
• Xenium Prime 5K panels（10x Genomics）：驗證 5,006 基因 panel、加選基因與 FFPE/新鮮冷凍樣本相容性。
• CosMx Human Whole Transcriptome Product Bulletin（Bruker Spatial Biology）：驗證 CosMx whole-transcriptome panel 的 18,935 基因規格。
• Stereo-seq Technology（Complete Genomics）：驗證 DNA nanoball 陣列與 0.22 µm 點徑的技術說明。
• C-SIDE spatial differential expression（Nature Methods）：驗證空間資料需處理細胞組成、空間位置與多重複統計推論。